다운스트림 단백질 분석을 위한 결핵균 의 세포벽 및 세포막 단백질의 분리 및 분획

우리의 연구는 직접적인 단백질체 및 면역학적 분석을 위해 결핵균의 불용성 세포벽과 세포막 단백질을 간단한 분획으로 분리하는 간소화된 방법을 개발하는 데 중점을 두었습니다. 전기영동 기술의 발전으로 이제 복잡한 단백질을 더 적은 수의 단백질 분획으로 분리할 수 있게 되어 기능적 단백질체학 및 면역학적 응용 분야를 위한 효율적인 질량 분석 기반 분리가 용이해졌습니다. 주요 과제로는 100밀리그램 이상으로 침전되는 소수성 단백질의 낮은 용해도와 SDS-PAGE 유도 변성이 포함되어 있어 효소 활성 분석과 같은 천연 확인이 필요한 다운스트림 적용을 방해합니다.

직접적인 단백질체 및 면역학적 분석을 위해 불용성 소수성 세포벽과 세포막 단백질을 정의된 수용성 분획으로 체계적으로 분리하는 현재 프로토콜은 없으며, 이는 기능을 이해하고 개입을 안내하는 데 핵심입니다. 우리의 향후 연구는 T 세포 항원 기반 진단을 개발하고 더 나은 질병 통제를 지원하기 위해 조기에 정확한 결핵 발견을 위해 결핵 집단 전반에 걸쳐 민감도, 특이성 및 성능을 평가하는 데 중점을 둘 것입니다. 시작하려면 Mycobacterium tuberculosis bacilli의 전체 세포 용해물에서 세포벽, 세포막 및 세포질 단백질 샘플을 얻습니다.

세포벽과 세포막 단백질을 등전점 포커싱 완충액에 가용화합니다. pH 범위 3 내지 10 및 4 내지 6 사이에 2% 양쪽전해질을 1 대 4의 비율로 첨가합니다. 이제 냉각수 수조를 사용하여 섭씨 4도로 유지되는 액체 등전 초점 시스템에서 가용화된 단백질을 분획합니다.

제조업체의 지침에 따라 12와트의 정전력을 적용하여 등전-초점 분리를 수행합니다. 진공 펌프로 개별 등전성 초점 분획을 수집합니다. 각 분획의 pH 값을 결정합니다.

분리된 분획 50마이크로그램을 SDS-PAGE에 투입하고 Coomassie Brilliant Blue 또는 은 염색을 사용하여 단백질을 시각화합니다. IEF로 분리된 세포벽 및 세포막 분획을 SDS 겔 전기영동 샘플 완충액과 혼합하여 시작합니다. 혼합물을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.

12.5% 분해능 겔과 4% 스태킹 겔이 있는 16 x 20cm 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 2차원에서 단백질 분획을 분리합니다. 그런 다음 13cm 길이의 단일 샘플 웰을 사용하여 샘플을 젤에 로드합니다. 염료 전면이 겔 바닥에 도달할 때까지 겔당 50밀리암페어의 정전류로 전기영동을 수행합니다.

전기영동 후 용출 완충액에서 겔을 10분 동안 평형화합니다. 기기 제조업체의 지침에 따라 젤을 전체 젤 용출 장치로 옮깁니다. 엘러기를 250밀리암페어의 정전류로 1시간 동안 작동시켜 겔에서 단백질을 용리한 다음 진공 펌프를 사용하여 겔에서 각각 3밀리리터를 측정하는 약 30개의 단백질 분획을 수집합니다.

비신코니닉산 단백질 분석을 사용하여 용출된 분획의 단백질 농도를 정량화합니다. 용출된 단백질 분획 10마이크로그램을 SDS-PAGE 분석에 적용하고 Coomassie Brilliant Blue 염색으로 밴드를 시각화합니다. Mycobacterium tuberculosis의 첫 번째 상청액(세포벽, 세포막 및 세포질 분획)에서 뚜렷한 단백질 밴딩 패턴이 관찰되어 성공적인 세포 내 분획이 확인되었습니다.

세포벽 단백질의 등전 초점은 pH 2.5 미만의 분획에서 가장 높은 단백질 농도를 나타냈습니다. 세포벽 IEF 분획의 SDS-PAGE는 주로 분획 1에서 8까지의 뚜렷한 단백질 밴드를 나타냈습니다. IEF에 의한 세포막 단백질 분리는 pH 4와 pH 10 사이의 주요 단백질 농도 피크를 나타냈으며, 가장 높은 농도는 pH 10 부근에서 발생했습니다.

세포막 IEF 분획의 SDS-PAGE는 분획 1에서 9까지 더 명확한 밴드를 가진 다양한 단백질 프로파일을 나타냈습니다. IEF로 분해된 세포벽 단백질의 분취 SDS-PAGE 분리는 주로 밀리리터당 100마이크로그램 미만의 분획을 생성했습니다. 용출된 세포벽 단백질 분획의 SDS-PAGE는 분획 6 내지 10에서 더 농축된 밴드와 함께 광범위한 단백질 분자량을 나타냈습니다.

세포막 단백질 분획의 분취 SDS-PAGE는 분획의 절반 이상이 밀리리터당 50에서 199마이크로그램 사이의 단백질 농도를 갖는 것으로 나타났습니다. 용출된 세포막 단백질 분획의 SDS-PAGE는 레인 1 내지 8 및 13 내지 16에서 농축된 밴드를 나타냈다.