현장 분리 칩을 이용한 난치성 토양 박테리아의 분리 및 배양 (iChip)

풍부한 미생물 저장소는 토양, 수역, 극한 환경 등 다양한 자연 환경에 존재합니다. 그러나 이 거대한 생물 다양성을 활용하는 것은 실험실 방법과 매체에 의해 크게 제한됩니다. 이러한 문화 장벽을 통과하고 생물 다양성을 활용함으로써 다양한 생명 공학 요구 사항을 해결하고 글로벌 과제를 해결할 수 있는 잠재력이 있습니다.

예를 들어, 항균제 내성의 발달은 전 세계 공중 보건에 영향을 미치고 있습니다. 실험실에서 배양하기 어려운 토양 박테리아는 항균 시스템의 글로벌 문제를 해결하는 데 유용할 수 있는 강력한 항균 활성을 가진 새로운 생리 활성 화합물을 생산할 수 있습니다. 전통적인 실험실 배양 기반 기술이 종종 유사한 알려진 미생물의 분리로 이어지기 때문에 엄청나게 다양한 환경 미생물과 그 제품은 탐구되지 않았습니다. 이 실험의 목표는 IChip 기술을 사용하여 난치성 토양 박테리아의 고처리량 배양을 현장에서 입증하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 배양하기 어려운 박테리아의 고처리량 현장 배양 및 항균 생성 박테리아의 회수에 사용할 수 있는 이 IChip 기술의 구성 및 사용을 이 기술의 적용으로 시연할 것입니다.

[발표자] 시작하려면 프레젠테이션 소프트웨어에서 절연 칩의 상단, 하단 및 중간 플레이트의 예비 설계를 만듭니다. 프리젠테이션 소프트웨어에서 모양 삽입 옵션을 사용하여 IChip 역할을 할 필수 치수의 원을 삽입합니다. IChip 채널을 나타내기 위해 더 작은 원을 삽입합니다. 작은 원을 원하는 패턴으로 배열하여 IChip의 상단, 하단 및 중간 플레이트에 대한 예비 디자인을 준비합니다. 디자인을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼 클릭 메뉴를 사용하여 예비 디자인을 그림으로 저장합니다. 예비 설계를 템플릿으로 사용하여 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 2차원 설계 작성을 시작합니다. 스케치 메뉴에서 미리 정의된 모양(주로 원)을 삽입하여 IChip 플레이트와 채널 영역에 대한 기본 디자인을 만듭니다. 치수 옵션을 사용하여 플레이트 및 채널의 실제 치수를 설정합니다. 확인을 클릭하여 디자인을 마무리한 다음 돌출 기능을 사용하여 2D 디자인을 원하는 두께의 3D 모델로 변환합니다. 마지막으로 파일 메뉴를 사용하여 3D 프린팅과 호환되는 스틸 리소그래피 파일 형식으로 3D 모델의 복사본을 저장합니다.

[발표자] 토양 샘플 수집에 필요한 모든 필수 품목을 수집하고 샘플을 수집할 장소에 도달하십시오. 지오코딩 모바일 애플리케이션을 열고 샘플링 사이트의 고유한 세 단어 주소를 찾아 기록합니다. 다음으로, 온도, 날짜, 시간, 샘플링 깊이, 날씨 및 요소에 대한 현장 노출과 같은 관련 샘플 메타데이터를 기록합니다. 삽과 IChip을 심을 폴리스티렌 상자에 70% 에탄올을 뿌립니다. 티슈 페이퍼로 깨끗이 닦고 에탄올을 완전히 자연 건조시키십시오. 그런 다음 오염을 제거한 삽을 사용하여 낙엽이나 암석과 같은 표면 잔해물을 제거하여 표토를 노출시킵니다. 이전과 같이 삽을 다시 오염 제거합니다. 삽을 사용하여 3-6 깊이의 토양에 접근하여 지하를 섭취하고 균일한 깊이에서 약 4-5kg의 토양을 폴리스티렌 상자로 옮깁니다. 상자는 약 75% 가득 차 있어야 합니다. 수집된 토양을 즉시 실험실로 다시 운반하십시오. 수집된 토양 샘플에서 파편, 암석 및 낙엽이 없는 토양 1g의 무게를 10ml의 멸균 식염수가 들어 있는 멸균 50mil 원심분리기 튜브에 넣습니다. 토양과 식염수를 혼합하면서 약 10초 동안 소용돌이치면서 토양 슬러리를 만듭니다. 튜브의 큰 토양 입자가 가라앉을 수 있도록 원심분리기 튜브를 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 상청액 토양 현탁액을 S로 표시된 새 시험관에 조심스럽게 옮깁니다. 토양 현탁액을 희석되지 않은 샘플로 사용하여 샘플 1ml를 새 튜브의 멸균 식염수 9ml로 옮겨 제로 희석을 수행합니다. 희석액은 10에서 10은 거듭제곱 5까지 준비합니다. 생물 안전 캐비닛 내부에서 70% 에탄올에 10분 동안 담가 IChip의 상판, 하판 및 중판의 표면 오염을 제거합니다. 탈이온수를 멸균된 물로 IChip 구성 요소를 세척하여 여분의 에탄올을 헹구고 멸균 페트리 접시를 자연 건조시킵니다. IChip의 중간 플레이트를 파종할 준비가 된 멸균 페트리 접시에 놓습니다. SMS 한천 배지를 전자레인지에 녹입니다. 식힌 다음 22.5ml의 SMS 한천을 45도에서 멸균 50ml 원심분리 튜브에 옮깁니다. 여기에 토양 샘플의 적절한 희석액 2.5ml를 첨가하고 기포의 유입을 피하면서 부드럽게 반전시켜 잘 혼합합니다. 전체 표면을 덮고 있는 IChip의 중간 플레이트 위에 약 3-4ml의 파종된 SMS 한천 배지를 천천히 붓습니다. 그런 다음 SMS 한천 배지를 약 5-10분 동안 굳힙니다. SMS 한천 배지가 설정되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 멸균 면도날을 사용하여 IChip 금속판 표면에서 여분의 SMS 한천을 긁어내어 개별 확산 챔버에 한천 플러그를 남깁니다. 0.03마이크로미터 폴리카보네이트 멤브레인 필터 중 하나에서 보호 시트를 제거한 후 멸균 겸자를 사용하여 IChip의 상단 블레이드 안쪽에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 멸균 겸자를 사용하여 시드된 금속판의 노출된 면에 또 다른 0.03마이크로미터 폴리카보네이트 멤브레인 필터를 놓습니다. IChip의 상단 및 하단 플레이트를 배치하고 중간 플레이트와 폴리카보네이트 멤브레인을 끼우고 모든 플레이트에 이러한 나사 구멍을 정렬하여 IChip 어셈블리를 완성합니다. 너트와 볼트를 단단히 조여 IChip 어셈블리를 고정합니다. 멸균 삽을 사용하여 폴리스티렌 상자의 토양 수집기에 IChip 크기보다 큰 함몰을 만듭니다. IChip 어셈블리를 움푹 들어간 곳에 수직으로 심고 IChip의 모든 표면이 완전히 덮이도록 흙으로 단단히 포장합니다. 그런 다음 2주에서 4주 사이의 원하는 기간 동안 배양 현장을 허용합니다. 배양하는 동안 멸균 증류수를 사용하여 토양 주변, 심은 IChip을 주기적으로 적셔 확산 챔버에 파종된 SMS 한천 플러그가 마르는 것을 방지합니다. 원하는 배양 후 심은 IChip 주변의 토양을 부드럽게 제거하여 회복합니다. 그런 다음 IChip을 멸균 식염수로 세척하여 부착된 토양 입자를 제거하고 추가 처리를 위해 생물 안전 캐비닛 내에서 옮깁니다. IChip 어셈블리에서 너트와 볼트를 풀고 IChip을 조심스럽게 분해합니다. 멸균 겸자를 사용하여 폴리카보네이트 멤브레인을 제거하고 IChip의 중간 플레이트를 준비된 페트리 접시로 옮깁니다. 멸균 목재 어플리케이터를 사용하여 각 확산 챔버 내에서 개별 한천 플러그를 회수합니다. 한천 플러그를 SMS 한천 또는 0.1X 트립산 대두 국물 한천과 같은 적절한 배지에 접종하여 실험실 재배를 시도합니다. 배양된 분리주는 테스터 균주를 사용한 한천 오버레이와 같은 일상적인 방법으로 항균 생산에 대해 스크리닝할 수 있습니다. 여기에서는 황색포도상구균 ATCC 29213 및 Acinetobacter baumannii B8342에 대한 IChip 한천 플러그에서 얻은 12개 배양, IC-1에서 12에 대한 대표적인 스크리닝 결과를 보여줍니다. 배양 IC-6 및 IC-8은 각각 그람 양성 및 그람 음성 테스터 균주에 대해 활성을 나타냅니다. 또는 현장에서 배양된 난치성 토양 박테리아를 포함하는 회수된 한천 플러그를 염색하고 이미지화하여 현장 조건에서 마이크로 콜로니의 성장을 확인합니다. 이 접근 방식을 사용하면 고처리량 방식으로 난치성 토양 박테리아를 현장에서 회수할 수 있습니다. 3D 프린팅된 IChip은 156개의 한천 플러그를 수용할 수 있습니다. 그러나 하나의 박테리아 세포가 IChip의 각 채널에 파종되도록 파종하는 동안 올바른 희석액을 선택해야 합니다. 그런 다음 필요한 박테리아를 실험실 조건에서 배양할 수 있는 경우 대사산물 생산, 효소 생산, 생체 고분자 생산 등과 같은 원하는 생체 활성에 대해 스크리닝할 수 있습니다. 그러나 일부 박테리아는 실험실 조건에서 자라지 않을 수도 있으며, 이러한 경우 미생물의 존재를 실현하고 생합성 잠재력에 접근하기 위해 메타게놈 접근 방식을 채택해야 할 수도 있습니다. 설명된 방법은 매우 쉽고 약간의 수정만으로 다양한 환경 조건에서 미생물을 생물 탐사하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다.