Name: ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 사용한 근골격계 조직의 원발성 섬모의 체적 이미징 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 배우세요 근골격계 조직에서 원발성 섬모의 3D 체적 이미징 및 분석 방법을 ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 활용하여. 이 기술은 조직 형태발생에서 섬모의 공간적 조직과 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

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<ol><li>Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+primary+cilia+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Expression of primary cilia in mammalian cells.</a> Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).</li>
<li>Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+highly+oriented+with+respect+to+collagen+direction+and+long+axis+of+extensor+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon.</a> J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).</li>
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<li>Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+primary+cilia+of+articular+chondrocytes+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Orientation of primary cilia of articular chondrocytes in three-dimensional space.</a> Anat Rec. 294 (3), 533-549 (2011).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+protein+IFT88+controls+post-natal+cartilage+thickness+and+influences+development+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arth+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The ciliary protein IFT88 controls post-natal cartilage thickness and influences development of osteoarthritis.</a> Arth Rheumatol. 74 (1), 49-59 (2021).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+IFT88+protects+coordinated+adolescent+growth+plate+ossification+from+disruptive+physiological+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Ciliary IFT88 protects coordinated adolescent growth plate ossification from disruptive physiological mechanical forces.</a> J Bone Miner Res. 37 (6), 1081-1086 (2022).</li>
<li>Andrea, C. E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+organization+reflects+polarity+in+the+growth+plate+and+implies+loss+of+polarity+and+mosaicism+in+osteochondroma%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Primary cilia organization reflects polarity in the growth plate and implies loss of polarity and mosaicism in osteochondroma.</a> Lab Invest. 90 (7), 1091-1101 (2010).</li>
<li>Ascenzi, M. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+localization%2C+length+and+orientation+of+chondrocytic+primary+cilium+on+murine+growth+plate+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of localization, length and orientation of chondrocytic primary cilium on murine growth plate organization.</a> J. Theor Biol. 285 (1), 147-155 (2011).</li>
<li>Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specificity+of+primary+cilia+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo.</a> Nat. Cell Biol. 17 (2), 113-122 (2015).</li>
<li>Larkins, C. E., Aviles, G. D. G., East, M. P., Kahn, R. A., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arl13b+regulates+ciliogenesis+and+the+dynamic+localization+of+Shh+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Arl13b regulates ciliogenesis and the dynamic localization of Shh signaling proteins.</a> Mol Biol Cell. 22 (23), 4694-4703 (2011).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13 (2), 155-164 (2004).</li>
<li>arivis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+%2347+-+Applying+Cellpose+models+in+arivis+Vision4D%22">Application Note #47 - Applying Cellpose models in arivis Vision4D</a>. , 1-20 (2021).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Note%3A+Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Application Note: Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. , (2019).</li>
<li>Ning, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-associated+wound+repair+mediated+by+IFT88+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cilia-associated wound repair mediated by IFT88 in retinal pigment epithelium.</a> Sci Rep. 13 (1), 8205-8219 (2023).</li>
<li>Palla, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+on+muscle+stem+cells+are+critical+to+maintain+regenerative+capacity+and+are+lost+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia on muscle stem cells are critical to maintain regenerative capacity and are lost during aging.</a> Nat Commun. 13 (1), 1439-1451 (2022).</li>
<li>Brewer, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+dynamic+ciliary+ARL13B+and+ADCY3+localization+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Postnatal dynamic ciliary ARL13B and ADCY3 localization in the mouse brain.</a> Cells. 13 (3), 259-277 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22 x 50mm 커버 슬립</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12373128 arivis Vision4D 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>이미지 분석 소프트웨어&nbsp;</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 980 Airyscan 2</td><td></td></tr><tr><td>CoverGrip 커버슬립 씰란트&nbsp;</td><td>비오티움&nbsp;</td><td>23005</td><td></td></tr><tr><td>Cryofilm type 3C(16UF) (시트 타입) 2.0 cm 너비</td><td>Section-lab</td><td>C-FUF303</td><td>Section-lab에서 직접 구매 가능</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1900 UV</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>일회용 베이스 몰드&nbsp;</td><td>epredia</td><td>58952</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma</td><td>20260630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 소프트웨어&nbsp;</td><td>옥스포드 인스트루먼트&nbsp;</td><td>N/A</td><td>3D 재구성을 위한 이미지 분석 소프트웨어&nbsp;</td></tr><tr><td>이멀젼 오일 518F</td><td>자이스</td><td>ISO 8036&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드</td><td>페더</td><td>02.075.00.006</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade 유리 안티페이드 마운턴트&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼 크라이오엠베딩 매체 (SCEM)</td><td>Section-lab</td><td>C-EM001</td><td>Section-lab에서 직접 구매</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>avantor</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Zen 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경용 프리웨어</td></tr></tbody></table>

arl13b-centrin-2 마우스 모델을 사용한 근골격계 조직의 원발성 섬모의 체적 이미징 및 분석

Volumetric Imaging and Analysis of Primary Cilia in Musculoskeletal Tissue using the ARL13B-CENTRIN-2 Mouse Model

6주 된 마우스의 성장판은 기술된 프로토콜과 조직에 매핑된 1차 섬모 조직을 사용하여 이미지화되었습니다. 성장판의 세 영역(휴지기, 증식성 및 비대성)의 이미지를 모두 캡처하여 분석 파이프라인을 통해 실행했습니다(그림 2A). 개별 세포는 DAPI 염색으로 식별할 수 있으며, 섬모 축삭은 빨간색, 중심소체는 녹색입니다. 이 방법을 사용하는 분해능은 개별 중심소체를 구별할 수 있을 만큼 충분히 높습니다(그림 2B). 이 해상도에서는 섬모를 3D 환경에서 시각화하여 다른 방향을 가리킬 수 있습니다(비디오 1).
더 높은 배율 목표를 가진 저해상도 이미지를 캡처하여 더 큰 조직 영역에 걸쳐 1차 섬모를 시각화할 수도 있습니다. 그러나 이는 3D에서 섬모 방향을 해석하는 데 적합하지 않습니다. 예를 들어, 관절 연골의 일차 섬모는 20x 대물렌즈로 이미지화되었으며, 이는 이 방법이 다른 조직에서도 작동한다는 것을 보여주었습니다(그림 2C). 이 해상도에서는 빨간색의 섬모 축삭을 식별할 수 있지만 중심소체는 구별하기가 더 어렵습니다. 연골하골은 많은 GFP 배경 신호를 나타내는 경향이 있어 이 조직에서 중심소체를 식별하기 어렵습니다.
이 파이프라인은 개별 세포, 일차 섬모 및 중심소체를 검출할 수 있으며, 10주 된 마우스와 같이 컬럼이 잘 정의되지 않은 고도로 조직화된 젊은 성장판과 오래된 성장판에 적합합니다(그림 3). 세포와 섬모는 z-stack에서 볼 수 있는 것처럼 3D로 감지됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig01.jpg"> 
그림 1: 실험적 워크플로우. 조직 채취에서 이미지 분석에 이르기까지 프로토콜의 여러 단계에 대한 순서도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig02.jpg"> 
그림 2: ARL13B-CENTRIN-2 마우스의 쥐 조직에 있는 원발성 섬모. (A) 40x 대물렌즈로 이미지화한 DAPI(흰색), CENTRIN-2(녹색), ARL13B(빨간색)의 6주 된 성장판. (B) 개별 1차 섬모와 두 개의 중심소체를 확대합니다. (C) 20x 대물렌즈로 촬영한 4주 된 쥐의 관절 연골 및 연골하골. (D) 근골격계 조직과 동일한 파이프라인을 사용하여 이미지화한 6주 된 마우스의 신장. (E) 신장의 개별 원발성 섬모와 중심소체를 보여주는 D 의 흰색 상자 확대. 눈금자 = 20μm(A,D), 4μm(B), 60μm(C), 6μm(E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig03.jpg"> 
그림 3: 세포 및 섬모 검출 파이프라인. 10주 된 성장판에 이미지 분석 파이프라인을 적용하는 예. (A) 소프트웨어에서 열린 이미지. (B) 세포 검출 파이프라인의 결과. (C) 섬모 및 중심소체 검출 파이프라인의 결과. 섬모는 분홍색이고 중심소체는 녹색입니다. 측면도는 해상도가 3D에서 다른 방향으로 향하는 섬모를 구별할 수 있을 만큼 충분히 높다는 것을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1: ARL13B-CENTRIN-2 마우스에서 6주 된 성장판의 3차원 재구성. 3차원 재구성은 Imaris 소프트웨어에서 수행되었으며 애니메이션 비디오로 녹화되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Video-1.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: 현미경 시스템의 이미지 획득 설정. (A) 스마트 설정 창을 사용하여 채널을 추가하고 Airyscan 모드를 선택합니다. (B) 타일 뷰어를 사용하여 이미지화할 타일을 선택하고 미리 볼 수 있습니다. (C) Airyscan 감지기 조정 창, 모든 타일이 녹색으로 바뀌면 Airyscan 감지기의 정렬이 확인됩니다. (D) 3개 채널에 대한 레이저 설정. (E) 획득 모드 및 Z-Stack 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S2: 현미경 시스템의 이미지 처리 설정. (A) Airyscan 처리 설정. (B) 스티칭 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-2.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S3: 사용자 지정 이미지 분석 파이프라인. (A) GFP 및 DAPI 채널을 사용한 세포 검출 파이프라인. (B) mCherry 및 GFP 채널을 각각 사용하는 1차 섬모 및 중심소체 검출 파이프라인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-3-.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 사용한 근골격계 조직의 원발성 섬모의 체적 이미징 및 분석

The primary cilium is a non-motile, solitary organelle assembled by most cell types. It is essential to the development and homeostasis of the skeleton ...

성장하는 팔다리를 더 잘 이해하기 위해 우리는 환경에 대한 세포의 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 세포 기관인 1차 섬모를 연구했습니다. 성장에서 섬모의 역할을 조사하기 위해 우리는 새로운 뼈가 자라는 연골층인 성장판 내에서 섬모를 이미징하고 있습니다. 1차 섬모는 길이가 5마이크로미터 미만으로 매우 작기 때문에 특히 3차원으로 이미지화하기가 어렵습니다.연골과 뼈와 같은 매트릭스가 풍부하고 부분적으로 석회화된 조직 내에서 이를 이미징하는 것은 위치, 방향 및 크기는 말할 것도 없고 그 존재를 정확하게 탐색하는 것을 훨씬 더 어렵게 만들 뿐입니다. 우리는 성장판 내의 모든 세포에서 원발성 섬모의 3D 조직을 매핑할 수 있으며, 아픈 세포가 조직 형태 형성과 관련하여 어디서 어떻게 방향을 잡는지 묻습니다. 원발성 섬모는 이전에 성장판에서 2D 또는 매우 적은 수로만 연구되었습니다.섬모체와 중심소체에 대한 내인성 형광 신호는 잡음에 대한 신호가 높기 때문에 섬모 식별의 확신을 제공하고 면역조직화학의 필요성을 방지합니다. 이 프로토콜은 또한 조직 내 수백 개의 섬모에 대한 고처리량 집단 이미징을 가능하게 하여 섬모를 우리가 연구하고 있는 형태 형성 이벤트와 공간적으로 연관시킬 수 있습니다. 이 이미징 및 분석 방법론은 조직과 장기에 걸쳐 원발성 섬모를 매핑하기 위해 다른 조직에 적용할 수 있습니다.이를 통해 일차 섬모 구조와 기능 사이의 연관성을 더 잘 이해할 수 있습니다. 시작하려면 준비된 마우스 조직의 냉동 극저온 절편을 취하고 슬라이드를 실온에서 수평으로 놓아 해동합니다. PBS 한 방울을 사용하여 슬라이드를 각각 5분씩 3회 세척하여 가짜를 제거합니다.슬라이드에 10마이크로몰 DAPI 용액을 바르고 1분 동안 염색합니다. 그런 다음 샘플을 장착하고 커버 슬립으로 덮고 밤새 실온에 두십시오. 커버 슬립 밀봉제를 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다.컨포칼 현미경을 설정하려면 컨포칼 현미경을 켜고 소프트웨어를 연 다음 시스템 버튼을 클릭하십시오. 획득 탭에서 스마트 설정을 클릭하여 채널을 설정하고 GFP, mCherry 및 DAPI 채널을 추가합니다. 그런 다음 해상도와 속도 사이의 ARI 스캔 삼각형에서 ARI 스캔 옵션과 sR8-Y 기능을 선택합니다.최상의 신호를 클릭한 다음 확인을 클릭하여 확인합니다. Microscope Control의 Locate 탭에서 오일 이멀젼이 있는 40회 및 1.4 대물렌즈를 선택합니다. 그런 다음 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 오일이 커버 슬립에 닿을 때까지 대물렌즈를 위로 올립니다.그런 다음 성장판 또는 다른 관심 영역을 광 경로 아래에 배치합니다. Locate 탭에서 Fluorescence를 클릭하고 DAPI를 선택합니다. 그리고 접안렌즈를 사용하여 조이스틱으로 슬라이드 홀더를 움직여 성장 플레이트 또는 관심 영역을 시야 아래에 배치합니다.획득 탭에서 DAPI 채널만 선택합니다. 연속을 클릭하여 화면에서 DAPI 채널의 이미지를 보고 성장판이 보이는지 확인합니다. 타일 뷰어를 열려면 Tiles 탭에서 Show Viewer를 클릭합니다.필요한 수의 타일(일반적으로 X 방향으로 타일 1개, Y 방향으로 3-5개의 타일)을 추가합니다. 그런 다음 미리보기 및 시작을 클릭합니다. 이제 타일이 성장판의 세 영역, 휴지기, 증식 및 비대성을 덮고 있는지 확인하십시오.필요한 경우 타일 위치와 번호를 조정합니다. 이미지 매개변수를 설정하려면 Acquisition 탭에서 Continuous를 클릭합니다. ARI 스캔 검출기를 정렬하려면 하단의 바둑판식 로제트 기호를 클릭하여 ARI 스캔 검출기 조정 창을 엽니다.모든 타일이 녹색으로 바뀔 때까지 기다립니다. 채널 탭에서 게인 마스터와 레이저 출력을 조정하여 화면에서 핵을 명확하게 볼 수 있습니다. 그런 다음 세 채널을 모두 선택하고 연속을 클릭하여 이미징을 시작합니다.ARI 스캔 감지기가 정렬되도록 합니다. Acquisition Mode 탭에서 이미지 크기, 픽셀 크기, 프레임 크기, 속도 및 평균 값을 정의합니다. Acquisition 탭에서 Z-Stack 체크박스를 선택하여 Z-stack imaging을 활성화합니다.그런 다음 DAPI 채널만 선택하고 연속을 클릭하여 화면에서 이미지를 봅니다. 이미징할 가장 가까운 평면으로 대물렌즈를 아래로 이동합니다. Z-Stack 탭에서 Set First Plane을 클릭한 다음 보려는 마지막 평면에 초점을 맞추고 Set Last Plane을 클릭하여 이미징 범위를 구성합니다.Z 스택 평면 사이의 간격을 0.15마이크로미터로 설정합니다. Z 스택 이미징 범위의 중앙으로 이동합니다. Tiles(타일) 탭의 Tile Regions(타일 영역)에서 Verify(확인)를 클릭한 다음 Set Z(Z를 설정하고 다음으로 이동)를 클릭합니다.이제 Focus strategy(포커스 전략) 탭에서 포커스 전략이 타일 설정에 정의된 Z 값 및 포커스 표면을 사용하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 Start Experiment(실험 시작)를 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. 이미지를 처리하려면 처리 탭으로 이동하여 단일 또는 배치 모드를 선택하고 ARI 스캔 처리를 선택한 다음 3D 처리 옵션을 선택하고 표준 자동 필터를 선택합니다.획득한 원시 이미지를 선택하고 처리를 시작합니다. ARI 스캔 처리를 완료한 후 처리 방법에서 스티칭(Stitching)을 선택합니다. New Output(새 출력), Fuse Tiles(퓨즈 타일), Correct Shading(올바른 음영) 및 All by Reference(참조별 모두)를 선택하고 참조 세트를 DAPI로 설정합니다.ARI 스캔 처리된 이미지를 선택하고 스티칭 프로세스를 시작합니다. 시작하려면 획득한 CZI 이미지 파일을 소프트웨어로 가져오고 분석 패널을 엽니다. 드롭다운 메뉴에서 새 파이프라인을 선택합니다.작업 추가 단추를 사용하여 파이프라인에 연산자를 추가합니다. 셀 감지 파이프라인을 만들려면 셀 포스트 Python 세그멘터를 파이프라인으로 가져옵니다. 모델 이름을 Cyto 2로, 입력 채널을 2로, 두 번째 채널을 3으로, 지름(마이크로미터)을 10으로 설정합니다.흐름 임계값은 0.4로, 셀 확률 임계값은 0입니다. 다음으로, 파이프라인 앞에 import document objects 연산자를 추가하고 이름을 Import Manual Labels로 바꿉니다. 그런 다음 파이프라인 뒤에 개체 기능 필터 연산자를 추가하고 이름을 크기 필터로 바꿉니다.Polygon 도구를 사용하여 첫 번째 평면과 마지막 평면에 관심 영역을 그립니다. 생성된 개체의 이름을 바꾸고 태그를 지정합니다. 분석 패널 상단에 있는 파란색 화살표를 클릭하여 파이프라인을 실행합니다.기본 섬모 및 중심소체 검출 파이프라인을 만들려면 분석 패널을 열고 드롭다운 메뉴에서 새 파이프라인을 선택합니다. 문서 개체 가져오기, 두 개의 임계값 연산자, 분할, 개체, 기능, 필터 및 구획과 같은 연산자를 파이프라인에 추가하고 조정합니다. 그런 다음 분석 패널 상단에 있는 파란색 화살표를 클릭하여 파이프라인을 실행합니다.Objects 창을 열고 셀, 기본 섬모 및 중심소체가 포함된 개체(여기서는 compartment cell이라고 함)를 선택하고 Import/Export를 클릭합니다. Excel 내보내기를 선택합니다. 하위 항목 수, 이름, 부모 이름, 3D 방향 바운드 짧은 쪽, 중간 쪽, 긴 쪽, 각도 XY, 각도 XZ, 각도 YZ, 경계 상자 X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, 크기 X, 크기 Y, 크기 Z, 형상 중심 X, Y, Z, 평면 첫 번째, 마지막, 개수, 메쉬, 볼륨 메쉬 및 저장할 표면 영역 메쉬와 같은 피쳐를 선택합니다.1차 섬모 조직은 6주 된 쥐의 성장판에서 성공적으로 매핑되었습니다. 고해상도 이미징은 3차원 환경에서 개별 중심소체와 1차 섬모를 시각화할 수 있는 능력을 보여주었습니다. 세포와 일차 섬모는 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 3D로 감지되며, 이를 통해 측면을 가리키는 기본 섬모와 뒤를 가리키는 섬모를 구별할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한​​ 쉽고 안정적​​인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.

설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

후각 감각 뉴런의 섬모는 신호 전달 캐스케이드의 단백질을 포함하고 있지만, 냉동 절편에서 그 분포에 대한 자세한 공간 분석은 어렵습니다. 여기에서는 전체 마운트 라벨링 및 섬모 단백질의 얼굴 시각화를 위한 최적화된 접근 방식에 대해 설명합니다.

마우스의 메인 후각 시스템의 섬모의 전체 마운트 라벨링

일차 섬모는 다양한 신호 경로에 영향을 미칩니다. 포유류 달팽이관은 평면 세포 극성(PCP) 신호 전달을 검사하는 데 이상적입니다. 섬모 기능 장애는 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향, PCP 판독에 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달을 분석하는 것입니다.

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최근 우리 라이브 셀에 기본 속눈썹 안쪽 translocating 다양 한 단백질에 대 한 전송 경로의 3 차원 (3D) 공간 위치 매핑. 여기 실험 설정, 생물 학적 샘플의 과정 및 접근을 새로 이미징 3D 슈퍼 해상도 형광에 대 한 데이터 분석에 적용이 종이 세부 기본 속눈썹 살고 있습니다.

라이브 주 Cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용

1 차적인 섬모는 센티미터와 관련되었던 세포 외 구조물입니다. 면역 형광 염색에 의한 1 차 적인 섬모 검출은 매우 높은 품질의 심상을 초래하는 비교적 간단한 절차입니다. 이 프로토콜에서, 1 차적인 섬모를 표현하는 섬유아세포는 형광 또는 공초점 현미경으로 고정되고, 면역 염색되고, 심상화되었습니다.

면역 형광에 의한 1 차 적인 섬모의 간단한 검출

이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

이미지를 분석하기 위해 인공 지능(Ai)을 사용하는 것은 일반적으로 사용되는 방법에 비해 강력하고 편향이 적으며 빠른 접근 으로 부상하고 있습니다. 여기서 우리는 Ai가 세포 세포, 1차 섬모를 인식하고 길이 및 염색 강도와 같은 특성을 엄격하고 재현 가능한 방식으로 분석하도록 훈련했습니다.

1차 섬모 평가에 대한 인공 지능 접근 방식

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

본 프로토콜은 이미지 정량화 방법을 사용하여 접안 렌즈의 주변 구조를 시각화하기 위한 새로운 전체 마운트 이미징을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 렌즈 마이크로스케일 구조와 렌즈 발달/기능 간의 관계를 더 잘 이해하기 위한 연구에 사용할 수 있습니다.

Whole Mount Imaging을 통해 Peripheral Lens 구조, 세포 형태 및 조직을 시각화하고 정량화할 수 있습니다.

여기에서는 마이크로컴퓨터 단층촬영을 기반으로 하는 방법을 자세히 설명하여 마우스의 두개악안면뼈의 3D 모델을 분할하고 측정하여 현재 방법으로 가능한 것보다 마우스의 두개악안면뼈 발달을 더 잘 평가할 수 있습니다.

3차원 마이크로컴퓨터 단층촬영을 사용한 마우스의 두개악안면 기형 분석

배우세요 근골격계 조직에서 원발성 섬모의 3D 체적 이미징 및 분석 방법을 ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 활용하여. 이 기술은 조직 형태발생에서 섬모의 공간적 조직과 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 사용한 근골격계 조직의 원발성 섬모의 체적 이미징 및 분석

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