Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol

우리는 개발 중에 특정 결정이 어떻게 규제되는지 이해하는 데 관심이 있습니다. 오가노이드 모델과 단일 셀로믹스 기술을 통해 이전에는 불가능했던 질문을 할 수 있게 되었습니다. 체외 오가노이드 모델을 사용하면 특히 신경능선과 같은 일시적인 세포 집단에 대해 더 많은 양의 데이터를 생성할 수 있습니다.

유의한 변동성 모델 출력은 여전히 주요 실험 과제로 남아 있습니다. 우리는 두개골 능선 세포가 분화 가능성을 확장하기 위해 전능성 유전자를 재발현한다는 것을 입증했습니다. 먼저 DMEM 녹아웃 배지에서 밀리리터당 2mg의 농도로 새로운 콜라겐분해효소 용액을 준비합니다.

70-80%의 confluent mESC를 포함하는 웰 플레이트에서 ESC 배지를 흡입합니다. 이제 우물 측면에 PBS 1ml를 부드럽게 추가합니다. 균일한 세탁을 위해 접시를 흔듭니다.

PBS를 피펫으로 빼내고 2ml의 콜라겐 분해 효소 용액으로 교체합니다. 섭씨 37도에서 30-45분 동안 배양합니다. 배양 20분 후 10X 배율로 광학 현미경으로 플레이트를 확인하고 그 이후에는 5분마다 플레이트를 확인합니다.

군체의 가장자리가 말려 보이면 플레이트 쪽을 세게 두드려 군체를 분리합니다. 5ml 혈청학 피펫을 사용하여 분리된 집락을 수집하여 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 콜로니를 16G에서 실온에서 3분 동안 원심분리합니다.

바닥의 집락을 방해하지 않고 원뿔형 튜브에서 가능한 한 많은 매체를 흡인합니다. 다음으로, 펠릿에 0.05% 트립신 용액 1ml를 첨가하고 배양합니다. P1000 및 P200 마이크로피펫을 사용하여 현탁액을 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 집락을 분리한 다음 2ml의 mESC 배양 배지를 추가하여 트립신을 차단합니다.

튜브를 160G으로 실온에서 3분간 원심분리합니다. 상층액을 피펫으로 빼낸 다음 1ml의 CNCC 분화 배지를 추가합니다. 자동화된 세포 계수 장치로 또는 현미경의 밑에 세포를 세고십시오, 그 후에 3의 농도, 50 마이크로리터 당 000의 살아있는 세포를 달성하기 위하여 CNCC 분화 매체에 있는 세포를 묽게 하십시오.

P200 마이크로피펫을 사용하여 50마이크로리터의 세포 현탁액을 TC가 아닌 U-바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩합니다. CNCC 분화 배지로 각 웰을 200마이크로리터로 채우고 배양합니다. 광학 현미경으로 분화된 세포의 24시간 배양이 포함된 플레이트를 관찰하여 각 웰의 바닥에서 명확한 경계가 있는 작은 클러스터가 보이는지 확인합니다.

플레이트를 밤새 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 둘째 날에는 각 웰에서 100마이크로리터의 배지를 천천히 제거합니다. 그런 다음 끝이 끝에서 3-4mm 떨어진 부분을 자른 P200 마이크로피펫을 사용하여 나머지 배지와 함께 신경구를 흡인합니다.

신경구와 남은 배지를 TC가 처리되지 않은 평평한 바닥의 96웰 플레이트로 옮깁니다. 광학 현미경으로 전송을 확인합니다. 각 웰을 200마이크로리터의 예열된 CNCC 분화 매체로 만듭니다.

4일차에는 각 웰에서 100마이크로리터의 배지를 흡입합니다. 100마이크로리터의 예열된 CNCC 분화 배지로 교체한 다음 다시 배양합니다. 5일차와 6일차에는 광학 현미경으로 신경구의 부착물을 확인합니다.

신경구에서 박리되는 더 가벼운 세포가 본체를 둘러싸기 시작하는지 확인하십시오. 주어진 구성에 따라 CNCC 유지 보수 매체를 준비합니다. 배지에 첨가하기 전에 0.22마이크로미터 필터를 통해 소 혈청 알부민을 여과합니다.

성장 인자가 추가되면 배지를 섭씨 4도에서 최대 3주 동안 보관하여 빛으로부터 보호하십시오. 100마이크로리터의 피브로넥틴 용액을 TC가 아닌 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 플레이트가 정지하는 동안 비 TC 처리된 평평한 바닥의 96웰 플레이트의 웰에서 가능한 한 많은 CNCC 분화 매체를 흡입합니다.

배지를 50마이크로리터의 Accutase로 교체하십시오. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 100 마이크로 리터의 CNCC 유지 보수 매체를 각 웰에 추가하여 Accutase를 담금질합니다.

수용 플레이트의 코팅된 웰에서 피브로넥틴을 제거합니다. 그런 다음 분리 된 철새 후 CNCC를 40 마이크로 미터 필터를 통해 수용판의 우물로 필터링합니다. 원하는 시점에 절단 팁 P200 마이크로피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 신경구를 DNA 저결합 2밀리리터 튜브로 전달합니다.

실온에서 3분 동안 신경구를 튜브에 가라앉힌 후 가능한 한 많은 매체를 피펫으로 빼낸 다음 1ml의 차가운 PBS로 헹굽니다. 장착 챔버를 준비하려면 현미경 슬라이드에 양면 투명 섬유가 없는 테이프 3겹을 놓습니다. 면도기를 사용하여 양면 테이프에 3mm x 8mm 창을 자릅니다.

입체경 아래에서 P200 절단 팁을 사용하여 투명화제의 신경구를 장착 챔버에 조심스럽게 피펫으로 삽입하십시오. 2X와 4X 사이의 배율을 사용하여 전체 챔버의 시야를 제공하고 신경구를 식별합니다. 챔버 표면에 커버 슬립을 놓고 측면을 가볍게 눌러 부착합니다.

비조직 플레이트의 신경권 배양은 5일째부터 균일한 부착을 보인 반면, 페트리 접시 배양은 신경구의 다양한 부착 및 융합을 보였으며, 특히 4일째에 뚜렷했습니다. 신경구의 크기 변동성은 4일차와 7일차에 페트리 접시 배양에 비해 96웰 플레이트 배양에서 크게 감소했습니다. 96웰 플레이트에서 신경구의 직경은 4일째에는 139마이크로미터에서 295마이크로미터, 7일째에는 383마이크로미터에서 552마이크로미터 범위였던 반면, 페트리 접시 배양은 더 넓은 범위를 보였다.

신경구의 세포 수는 기하급수적으로 증가하여, 2일차 평균 1,082개에서 9일차에는 48,352개로 증가했습니다. 지름 성장은 선형적이었으며, 2일차 평균 136마이크로미터에서 9일차 570마이크로미터로 증가했습니다. 면역형광 분석을 통해 신경구체와 박리세포가 9일차와 13일차에 CNCC 마커 AP2 알파 및 SOX9와 EMT 마커 TWIST1을 발현하는 것을 확인했습니다.

PAX7은 신경영역에만 존재했습니다.