2025년 2월 28일
여기에서는 인간 피험자의 눈물 및 타액과 같은 생물학적 액체에서 수집된 세포외 소포체(EV)의 특성화 방법을 보여줍니다. 이 방법에 사용된 스캐너는 샘플의 1μL에서 EV의 표현형, 크기 및 총 입자 수를 감지할 수 있습니다.
세포외 소포체(extracellular vesicles)는 생리학적 상태를 반영하는 질병 바이오마커(biomarker) 역할을 합니다. 우리의 접근 방식은 작은 눈물 부피에서 풍부한 데이터를 추출하여 생물학적 유체에 대한 EV 연구를 발전시킬 수 있습니다. 주요 실험 과제에는 작은 샘플에서 충분한 세포 외 소포 농도 확보, 분리 중 샘플 손실 최소화, 칩 과포화 또는 약한 신호 감지를 방지하기 위한 분석 최적화가 포함됩니다.
이 프로토콜은 분리 단계를 건너뛰어 처리 시간을 단축하고 소량의 샘플에서 세포 외 소포체 분석을 가능하게 하여 눈물과 같은 제한된 생물학적 샘플에 이상적입니다. 비침습적 바이오마커는 각막 질환의 조기 발견 및 관리에 매우 중요합니다. 세포외 소포체 바이오마커는 질병 모니터링, 맞춤형 치료, 환자 순응도 향상 및 삶의 질 향상을 가능하게 합니다.
우리 연구실은 KC 피험자의 눈물 샘플에서 세포외 소포 분석을 개척하여 고유한 tEV 시그니처를 식별했습니다. 이는 미래의 진단 및 EV 중심의 치료 목표를 위한 길을 열어줍니다. 시작하려면 생물학적 샘플과 테트라스파닌 칩을 작업 공간에 배치합니다.
피펫: 인간 테트라스파닌 키트의 용액 B와 미리 혼합된 70마이크로리터의 인간 생물학적 샘플을 칩에 넣습니다. 샘플 증발을 방지하기 위해 칩 세척판에 필름을 놓습니다. 16시간 후 접시를 칩 와셔에 넣습니다.
제자리에 잠그고 뚜껑을 닫습니다. 칩 와셔에서 CW-TETRA v0 옵션을 누릅니다. 칩을 세척하는 동안 칩당 300마이크로리터의 차단 용액을 준비합니다.
차단 용액에 칩당 각 항체 0.6마이크로리터를 추가합니다. 차단 용액을 항체 칵테일로 볼텍스하여 철저한 혼합을 보장합니다. 칩 세척이 완료되면 각 칩 위에 항체 칵테일과 함께 250마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다.
그런 다음 덮개를 닫고 계속을 누릅니다. 칩 와셔가 짹짹 소리를 내면 칩 세척판을 제거하십시오. 칩을 경사로 위로 이동합니다.
플레이트를 칩 와셔에 다시 넣고 제자리에 단단히 고정되었는지 확인합니다. 덮개를 닫고 계속을 누릅니다. 시작하려면 나노 입자 분석기를 켭니다.
나노 입자 분석기에 연결된 바탕 화면에서 스캐닝 소프트웨어 프로그램을 실행합니다. 칩 폴더를 선택하여 각 테트라스파닌 칩을 선택하고 척의 칩 위치에 배치합니다. Chip Position 아래에 있는 세 개의 사각형을 클릭하여 형광을 켭니다.
사각형이 노란색, 파란색, 빨간색으로 바뀝니다. 척 뚜껑을 누르고 당겨서 제거합니다. 그런 다음 샘플이 로드된 테트라스파닌 칩을 척에 단단히 고정합니다.
척 뚜껑의 못을 구멍에 맞추고 아래로 누릅니다. 뚜껑을 밀어 제자리에 고정합니다. 그런 다음 척을 무대에 놓고 제자리에 고정합니다.
그런 다음 소프트웨어 인터페이스에서 Scan Chips를 클릭한 다음 OK를 클릭합니다. 스테이지가 기계 안으로 완전히 이동되면 도어를 닫습니다. 스캔이 완료되면 도어를 열어 스테이지를 꺼내고 결과를 확인합니다. 스캔에 성공했다면 칩을 버리십시오.
척에 다음 칩 세트를 놓습니다. 또는 빈 척을 스테이지로 되돌립니다. 소프트웨어를 종료하고 완료되면 컴퓨터를 끕니다.
CD63, CD81 및 CD9 채널에서 세포외 소포체의 최적 형광 수준이 관찰된 반면, MIgG 제어 채널은 검은색으로 유지되어 제어 특이성을 확인했습니다. CD81은 생물학적 유체에 대해 환원되었습니다. CD63, CD81 및 CD9 채널에서 형광이 없다는 것은 세포외 소포체가 없음을 나타냅니다.
형광의 과포화가 명백하여 특히 CD63, CD81 및 CD9 채널에서 과도한 라벨링으로 인해 의미 있는 데이터를 식별하기 어려웠습니다.
이 연구는 눈물이나 타액과 같은 인간 생체액체에서 채취한 세포외 소포체(EVs)를 특성화하는 새로운 방법을 제시합니다. 테트라스파닌 칩을 사용하여, 최소한의 시료 부피로부터 EVs 분석을 용이하게 하여 질병 모니터링을 위한 비침습적 바이오마커 연구를 발전시킵니다.
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.