Name: Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: 배우세요 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 특성화하는 방법으로, 테트라스파닌 칩을 활용하여 눈물 등 소량 샘플에서 비침습적 바이오마커를 분석합니다. 이 기술은 각막 질환 조기 진단 및 맞춤형 치료 개발에 활용됩니다.

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<table><tbody><tr><td>ChipWasher 100</td><td>NanoView</td><td>EV-CW100</td>은 <td>테트라스파닌 칩을 배양, 세척, 헹굼 및 건조합니다. 이 현재 모델은 더 이상 사용할 수 없습니다. 구매 시점 가격: $9,995.00&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoView 분석기 소프트웨어</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>는 칩 정보를 분석하고 추가 분석을 위한 엑셀 파일을 생성합니다. 더 이상 사용할 수 없습니다.</td></tr><tr><td>ExoView R100</td><td>NanoView</td><td>EV-R100</td><td>3가지 파장에서 테트라스파닌 칩을 스캔하는 데 사용됩니다. 이 현재 모델은 더 이상 사용할 수 없습니다. 구매 시점 가격:&nbsp; $110,000.00</td></tr><tr><td>ExoView 스캐너 소프트웨어</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>는 3가지 다른 파장에서 칩을 스캔합니다. 더 이상 사용할 수 없습니다.</td></tr><tr><td>인간 테트라스파닌 키트</td><td>Unchained Labs</td><td>EV-TETRA-C</td><td>에는 8개의 테트라스파닌 칩, 인큐베이션 솔루션, 차단 솔루션, CD63 항체, CD81 항체, CD9 항체, 솔루션 A, 솔루션 B, USB 및 플레이트 커버가 포함됩니다.</td></tr></tbody></table>

characterizing extracellular vesicles from biological fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids

칩의 스폿을 분석할 때 CD63, CD81 및 CD9 채널에서 형광 표지된 EV를 관찰하여 최적의 EV 농도를 목표로 하고 MIgG 채널30,91은 그림 3A에서 볼 수 있는 제어 채널이므로 검은색으로 유지되어야 합니다. CD81은 생물학적 유체에 대해 감소될 것입니다. CD63, CD81 및 CD9 채널에 형광이 없으면 EV가 없는 것입니다(그림 3B). 칩이 과포화되지 않도록 주의하십시오(그림 3C). 이로 인해 분석 소프트웨어가 EV의 크기, 총 입자 수 및 표현형의 정확도를 계산하기 어렵게 됩니다. 최적의 농도 지점에서 분석 소프트웨어는 EV의 크기(50-200nm), 총 입자 수 및 테트라스파닌 발현을 측정할 수 있으며(그림 4) 추가 분석을 위해 개별 스프레드시트로 내보낼 수 있습니다. 테트라스파닌 분석에는 EV의 표면 단백질의 공동 국소화가 포함됩니다. 공동 국소화는 "/"로 표시됩니다(예: "CD63/CD81"). 이것은 CD63과 CD81이 결합된다는 것을 의미하지 않습니다. 이는 CD63과 CD81이 모두 EV 표면에 위치한다는 것을 의미합니다.
이러한 결과는 건강한 샘플과 병든 샘플 간에 귀중한 통찰력을 제공합니다. 건강한 샘플 또는 질병에 걸린 샘플이 더 많은 EV, 더 크거나 작은 EV, EV의 표현형을 생성하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 이러한 특성의 일부 또는 전부는 질병의 생물 발생 및/또는 진행에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 이러한 결과를 통해 테트라스파닌 수치가 없거나 증가하는지 확인할 수 있으며, 이는 세포 과정과 EV의 형성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig1.jpg"> 
그림 1: 다양한 EV의 유형과 크기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig2.jpg"> 
그림 2: 테트라스파닌 칩이 EV를 캡처하고 감지하는 방법의 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig3.jpg"> 
그림 3: EV 농도 최적화. (A) EV의 최적 농도. (B) 음성 결과: EV가 없습니다. (C) EV의 과포화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig4.jpg"> 
그림 4: 나노 입자 분석기로 생성된 데이터. (A) 나노미터 단위로 측정한 EV 직경 크기. (B) EV의 총 입자 수. (C) EV 공동 국소화 표현형. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>기술</td>
			<td>장점</td>
			<td>제한</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>초원심분리기</td>
			<td>고순도42,43</td>
			<td>EV 형태소 변경42,44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>균질성42,45</td>
			<td>대용량필요 42,44,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>기능42,43</td>
			<td>비싼42,43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>유세포 분석</td>
			<td>여러 시점에서 표본 평가47</td>
			<td>약한 신호48,49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>다중 엔드포인트47,50</td>
			<td>모공 막힘51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>고처리량 단일 EV 분석52,53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Centrifugation</td>
			<td>고순도 샘플 생산54</td>
			<td>노동 집약적55,56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>다양한 샘플55,57</td>
			<td>시간이 많이 소요됨55,58 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>상당한 수율 손실54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>강수량</td>
			<td>심플59,60</td>
			<td>오염36,44,61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>빠른61,62</td>
			<td>비특이적63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>높은 수율44,59,62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>중성 pH36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>여과</td>
			<td>심플64 </td>
			<td>트랩 엑소좀:65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>패스트64</td>
			<td>큰 수포 손상36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>저렴한64</td>
			<td>필터 케이크66,67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>엑소좀 막힘65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: EV 절연 기술의 장점과 한계. EV의 장점과 제한 사항을 포함하여 EV를 격리하는 다양한 방법 목록입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>기술</td>
			<td>장점</td>
			<td>제한</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>동적 광 산란</td>
			<td>1nm에서 6μM 크기의 입자 측정78 </td>
			<td>큰 크기 범위의 복잡한 엑소좀 샘플측정에는 적합하지 않음 79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>하한은 10nm이며 단분산 시스템에 적합합니다79 </td>
			<td>오염된 단백질과 엑소좀을 구별할 수 없음79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>투과 전자 현미경 (TEM)</td>
			<td>엑소좀의 형태 관찰79,80 </td>
			<td>복잡한 시료 전처리79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>내부 구조관찰 81 </td>
			<td>과장된 형광 신호로 인해 크기와 모양에 따라 엑소좀을 구별할 수 없음82 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>나노 입자 추적 분석</td>
			<td>10 nm에서 2 μM 범위에서 엑소좀의 농도, 크기 및 크기 분포 측정78 </td>
			<td>EV를 단백질 응집체 및 기타 오염 물질과 구별할 수 없음83 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>빠른 시료 준비 및 측정78,84</td>
			<td>고가의 NTA 악기85 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>샘플은 기본 형태84로 회수할 수 있습니다. </td>
			<td>진동에 민감함85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>웨스턴 블롯(WB)</td>
			<td>마커 단백질을 정성적 및 정량적으로 분석할 수 있음79,86 </td>
			<td>복잡하고 시간이 많이 걸린다79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>세포 배양 배지의 엑소좀 분석79 </td>
			<td>EV 분리물에는 지단백질 및 기타 오염 물질이 포함될 수 있습니다86 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">유세포 분석</td>
			<td>더 높은 감도와 고해상도 이미징</td>
			<td rowspan="2">400nm의 검출 한계로 시간이 많이 걸리고 힘들다79,88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>염색된 엑소좀과 격납 장치 구별87 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>낮은 시료 농도필요 79 </td>
			<td>광 신호는 정확도와 해상도를 방해합니다88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>엑소뷰</td>
			<td>엑소좀에서 테트라스파닌(CD9, CD63, CD81) 측정89 </td>
			<td>더 큰 EV 크기를 측정하지 않음75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EV 화물 단백질측정 90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: EV 특성화 기술의 장점과 한계.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

Extracellular vesicles (EVs) are structures that are produced from cells and participate in intercellular communication by transporting biomolecules from ...

세포외 소포체(extracellular vesicles)는 생리학적 상태를 반영하는 질병 바이오마커(biomarker) 역할을 합니다. 우리의 접근 방식은 작은 눈물 부피에서 풍부한 데이터를 추출하여 생물학적 유체에 대한 EV 연구를 발전시킬 수 있습니다. 주요 실험 과제에는 작은 샘플에서 충분한 세포 외 소포 농도 확보, 분리 중 샘플 손실 최소화, 칩 과포화 또는 약한 신호 감지를 방지하기 위한 분석 최적화가 포함됩니다.이 프로토콜은 분리 단계를 건너뛰어 처리 시간을 단축하고 소량의 샘플에서 세포 외 소포체 분석을 가능하게 하여 눈물과 같은 제한된 생물학적 샘플에 이상적입니다. 비침습적 바이오마커는 각막 질환의 조기 발견 및 관리에 매우 중요합니다. 세포외 소포체 바이오마커는 질병 모니터링, 맞춤형 치료, 환자 순응도 향상 및 삶의 질 향상을 가능하게 합니다.우리 연구실은 KC 피험자의 눈물 샘플에서 세포외 소포 분석을 개척하여 고유한 tEV 시그니처를 식별했습니다. 이는 미래의 진단 및 EV 중심의 치료 목표를 위한 길을 열어줍니다. 시작하려면 생물학적 샘플과 테트라스파닌 칩을 작업 공간에 배치합니다.피펫: 인간 테트라스파닌 키트의 용액 B와 미리 혼합된 70마이크로리터의 인간 생물학적 샘플을 칩에 넣습니다. 샘플 증발을 방지하기 위해 칩 세척판에 필름을 놓습니다. 16시간 후 접시를 칩 와셔에 넣습니다.제자리에 잠그고 뚜껑을 닫습니다. 칩 와셔에서 CW-TETRA v0 옵션을 누릅니다. 칩을 세척하는 동안 칩당 300마이크로리터의 차단 용액을 준비합니다.차단 용액에 칩당 각 항체 0.6마이크로리터를 추가합니다. 차단 용액을 항체 칵테일로 볼텍스하여 철저한 혼합을 보장합니다. 칩 세척이 완료되면 각 칩 위에 항체 칵테일과 함께 250마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다.그런 다음 덮개를 닫고 계속을 누릅니다. 칩 와셔가 짹짹 소리를 내면 칩 세척판을 제거하십시오. 칩을 경사로 위로 이동합니다.플레이트를 칩 와셔에 다시 넣고 제자리에 단단히 고정되었는지 확인합니다. 덮개를 닫고 계속을 누릅니다. 시작하려면 나노 입자 분석기를 켭니다.나노 입자 분석기에 연결된 바탕 화면에서 스캐닝 소프트웨어 프로그램을 실행합니다. 칩 폴더를 선택하여 각 테트라스파닌 칩을 선택하고 척의 칩 위치에 배치합니다. Chip Position 아래에 있는 세 개의 사각형을 클릭하여 형광을 켭니다.사각형이 노란색, 파란색, 빨간색으로 바뀝니다. 척 뚜껑을 누르고 당겨서 제거합니다. 그런 다음 샘플이 로드된 테트라스파닌 칩을 척에 단단히 고정합니다.척 뚜껑의 못을 구멍에 맞추고 아래로 누릅니다. 뚜껑을 밀어 제자리에 고정합니다. 그런 다음 척을 무대에 놓고 제자리에 고정합니다.그런 다음 소프트웨어 인터페이스에서 Scan Chips를 클릭한 다음 OK를 클릭합니다. 스테이지가 기계 안으로 완전히 이동되면 도어를 닫습니다. 스캔이 완료되면 도어를 열어 스테이지를 꺼내고 결과를 확인합니다. 스캔에 성공했다면 칩을 버리십시오.척에 다음 칩 세트를 놓습니다. 또는 빈 척을 스테이지로 되돌립니다. 소프트웨어를 종료하고 완료되면 컴퓨터를 끕니다.CD63, CD81 및 CD9 채널에서 세포외 소포체의 최적 형광 수준이 관찰된 반면, MIgG 제어 채널은 검은색으로 유지되어 제어 특이성을 확인했습니다. CD81은 생물학적 유체에 대해 환원되었습니다. CD63, CD81 및 CD9 채널에서 형광이 없다는 것은 세포외 소포체가 없음을 나타냅니다.형광의 과포화가 명백하여 특히 CD63, CD81 및 CD9 채널에서 과도한 라벨링으로 인해 의미 있는 데이터를 식별하기 어려웠습니다.

characterizing-extracellular-vesicles-from-biological-fluids

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

혈액에 존재하는 세포외 소포체는 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커로 제안되었습니다. 여기에서는 말초 혈액 샘플에서 대형 원형질막 유래 미세소포를 분리하고 기존 유세포 분석 및 웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 통한 후속 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

이 프로토콜에서 우리는 형광 기반 나노-추적 분석 하 여 인간의 전체 혈액에서 세포 외 vesicles의 신속한 격리 및 특정 마커의 특성화에 대 한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 제시 결과 재현성의 높은 레벨을 표시 하 고 셀 문화 supernatants 조정 될 수 있습니다.

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

프로토콜 셀 문화 supernatants 함께 사용 하기 위해 작은 extracellular 소포 (EV)에 표면 epitopes를 감지 하도록 설계 된 재현 방법을 설명 합니다. 그것은 항 체를 표면 항 원 CD9, 인식 CD81 그리고 CD63, 함께 하는 비즈를 사용 하 여 특정 EV immunoprecipitation 활용. 메서드는 다운스트림 흐름 cytometry 분석에 최적화 되어 있습니다.

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

최신 세대의 EV 특성화 도구는 여러 파라미터에 대한 단일 EV 분석이 동시에 가능합니다. 나노유세포분석은 표지 없이 45nm보다 큰 모든 생물학적 입자를 측정하고 다양한 형광 표지 기술로 아집단의 특정 특성을 식별합니다.

나노유세포분석을 통한 단일 세포외 소포 막횡단 단백질 특성 분석

이 기사에서는 인간 플라즈마 유래 세포외 소포체(EV)의 분리, 특성화 및 정량화를 위한 방법론을 설명하고 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 EV 단백질체의 무표지 분석을 위한 워크플로우를 제시합니다.

심혈관 바이오마커 발견을 위한 혈장 유래 세포외 소포체의 분리, 특성화 및 단백질체 분석

이 프로토콜은 중간엽 기질 세포에서 방출되는 세포외 소포체(EV)를 분류하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 특히 기기 설정 및 분류 조건의 최적화에 중점을 둡니다. 목표는 세포외 소포체의 특성을 보존하면서 분류하는 것입니다.

세포외 소포 격리를 위한 성공적인 분류 설정

배우세요 생물학적 유체에서 세포외 소포체를 특성화하는 방법으로, 테트라스파닌 칩을 활용하여 눈물 등 소량 샘플에서 비침습적 바이오마커를 분석합니다. 이 기술은 각막 질환 조기 진단 및 맞춤형 치료 개발에 활용됩니다.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

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