Name: 인간 장내 오가노이드(Intestinal Organoids)의 신경 분포(Nervation of Human Intestinal Organoids) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 배우세요 인간 장내 오가노이드에 장신경계를 통합하는 조직공학 기술을 통해 단장증후군 치료를 위한 생체공학 장기 개발 방법을. 이 연구는 소아 장기능 장애 환자를 위한 혁신적 치료 기반을 제공합니다.

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<ol><li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Semin Pediatr Surg. 19 (1), 3-9 (2010).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>100x 비필수 아미노산 용액(NEAA)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07920</td><td>"효소 세포 분리 시약"</td></tr> <tr><td>B-27 보충제(50개), 비타민 A 마이너</td>스 <td>ThermoFischer Scientific</td><td>12587010</td><td>For ENCC</td></tr><tr><td>B-27 보충제(50x), 무혈청</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>HIO</td></tr><tr><td>Bright-Line Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 초저 부착 마이크로플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning Flat-Bottom Plate 3516 6</td><td>웰VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Media</td><td>Thermo Fischer</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Media</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2858501</td><td>ENCC 플레이트에 사용되는 대체 줄기 세포 매체.</td></tr><tr><td>파인 팁 겸자</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle i160</td><td>Thermo Scientific</td><td>50145522</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Gibco HEPES 1 M</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Neurobasal Medium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>글루타그로, 200 mM, 100x</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>H9 human ESC</td><td>Wicell International Stem Cell Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HyCloneTM FBS Defined</td><td>VWR</td><td>16777-002</td><td></td></tr><tr><td>LabGard Biological Safety Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>Nu-430-400</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR 기저 멤브레인 매트릭스, 페놀 레드-프리, LDEV-프리</td><td>코닝</td><td>356231</td><td>"투명 3D 기저 멤브레인 매트릭스"</td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스, LDEV-프리</td><td>코닝</td><td>354277</td><td>"3D 기저 멤브레인 매트릭스"</td></tr><tr><td>마이크로피펫</td><td>Eppendorf (100-1000, 20-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>"줄기세포 배지" 카탈로그 번호에는 미리 대량으로 추가할 수 있는 5x 보충제가 포함되어 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>N-2 보충제 (100x)</td><td>HIO N-2</td>보충제용 <td>Gibco</td><td>17502048</td></tr><tr><td>, CTS(세포 치료 시스템)</td><td>ENCC용 Thermo Fisher</td><td>A1370701</td><td>. 약간 배합이 다릅니다.</td></tr><tr><td>Nikon DS-Fi2 TS-100 현미경</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Noggin 조절 매체</td><td>Texas Medical Center 소화기 질환 센터 GEMS 코어, 엔테로이드/오가노이드 서브 코어</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 활성 A</td><td>세포 안내 시스템</td><td>GFH6-100</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 BMP-4</td><td>Fisher Scientific</td><td>314BP010</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF 단백질, CF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF basic/FGF2 (146 aa) 단백질</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>233-FB-010</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-4</td><td>Peprotech</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5872</td><td>"줄기세포 해리 시약"</td></tr><tr><td>레티노산</td><td>SIGMA</td><td>R2625-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-free 마이크로퓨지 튜브, 2 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12425</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 컨디셔닝 배지</td><td>Texas Medical Center 소화기 질환 센터 GEMS 코어, 엔테로이드/오가노이드 서브 코어</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542, Tocris Bioscience</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>표준 와이드 오리피스 피펫터 팁</td><td>VWR</td><td>89049-166</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Chir99021 in Solution</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터 피펫 팁</td><td>VWR (1000uL, 200uL, 10uL)</td><td>76322-154, 76322-150, 89174-520</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>줄기세포 기술</td><td>7180</td><td>ENCC 플레이트에 사용되는 대체 3D 기저막 매트릭스.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

인간 장내 오가노이드(intestinal organoids)의 신경 분포(nervation of human intestinal organoids)

Innervation of Human Intestinal Organoids

ENS는 연동 운동, 영양소 흡수, 체액 수송 및 상피 장벽 유지를 포함한 성숙한 소장의 필수 기능을 조절합니다. 따라서 HIO를 신경 분포시키는 목표는 이러한 구문에 보다 성숙하고 높은 수준의 기능을 개발하는 데 필요한 요소를 제공하는 것입니다. 이를 위해 우리 연구실은 HIO 내 ENS의 발달과 여러 단계에서의 기능적 결과를 구체적으로 연구합니다.
시간 경과에 따른 세포 성장, 분화 및 형태 형성을 모니터링하여 다음 단계로 진행하기 전에 각 단계가 예상대로 진행되고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. ENCC 분화 및 스페로이드 형성은 최대 3주에 걸쳐 발생하며, 분화 후 ENCC의 대표적인 명시야 현미경 사진과 그림 2에 표시된 ENCC 스페로이드 형성의 여러 단계에서 발생합니다. ENCC는 12일째까지 세포 단층 내에서 가시적인 응집체를 형성하기 시작해야 하며, 초저 부착 플레이트에 재도금된 후 자발적인 스페로이드 형성이...

인간 장내 오가노이드(Intestinal Organoids)의 신경 분포(Nervation of Human Intestinal Organoids)

The complexity of intestinal cytoarchitecture and function poses significant challenges for the creation of the bioengineered small intestine. Techniques ...

본 연구는 단장 증후군에 대한 해결책으로 조직 조작된 장의 생성에 초점을 맞추고 있습니다. 우리 연구실은 장 신경계의 통합을 최적화하고 공간 조직, 세포 다양성 및 기능을 최적화하는 데 중점을 두고 있습니다. 우리는 언젠가 생체공학적 장을 만들어 장부전으로 고통받는 아이들을 위해 삶을 변화시키는 솔루션을 만들 수 있기를 바랍니다.인간 장 오가노이드에 신경을 분포시키려면 인간의 장 발달을 모방해야 하며, 이는 어려울 수 있습니다. 장 신경계의 발달에는 생화학적 신호전달과 생체역학적 힘이 모두 필요합니다. 우리 연구실의 향후 연구는 인간 장 오가노이드 내에서 장 신경계 발달을 최적화하는 데 중점을 두고 있습니다.우리는 세포 다양성뿐만 아니라 공간 조직을 연구하고 있으며, 최근에는 Dr.Herath가 개발한 새로운 3D 이미징 기술을 사용하여 장내 오가노이드 내의 ENS를 강력하게 특성화하고 정량화할 수 있습니다. 이것은 우리의 모델을 개선하고 인간의 장 발달과 기능을 요약하는 데 도움이 될 것입니다. 먼저, 15-21일째에 배양된 장 신경능선세포 또는 ENCC 스페로이드의 플레이트를 가져와서 웰에서 배지를 조심스럽게 제거합니다.따뜻한 효소 세포 분리 시약 1ml를 웰에 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트의 측면을 두드려 스페로이드 해리를 용이하게 합니다. 끝이 넓은 입 모양의 P1000 마이크로피펫을 사용하여 세포가 균질해질 때까지 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합물을 적정합니다.ENCC 서스펜션을 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 1ml의 따뜻한 신경능선 세포 배지로 웰을 세척하여 남아 있는 세포를 수집한 다음 이를 원뿔형 튜브에 추가합니다. 이제 300G에서 1분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.그런 다음 멸균 피펫 팁을 사용하여 상층액을 흡입합니다. 그 후, 입이 넓은 피펫 팁을 사용하여 1ml의 따뜻한 신경능선 세포 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 입이 넓은 피펫 팁을 사용하여 인간 장 오가노이드 플레이트의 모든 웰에서 배양된 mid-hindgut 스페로이드를 수집하고 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.계산된 부피의 ENCC 현탁액을 중간 뒷장 스페로이드가 들어 있는 원뿔형 튜브에 추가합니다. 입구가 넓은 피펫 팁을 사용하여 혼합물을 부드럽게 분쇄하여 스페로이드와 ENCC가 균일하게 혼합되도록 합니다. 결합된 세포 현탁액을 300G에서 1분 동안 원심분리합니다.멸균 피펫 팁을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 그런 다음 생성된 세포 펠릿을 차가운 페놀이 없는 성장 인자 감소된 기저막 매트릭스에 재현탁시킵니다. 다음으로, 투명한 기저 멤브레인 매트릭스에 있는 재현탁된 중간 뒷장 스페로이드와 ENCC의 30마이크로리터 방울을 각 건조 웰의 중앙에 피펫팅합니다.모든 물방울이 도금되면 플레이트를 덮고 뒤집은 다음 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 0일차에 투명한 기저막 매트릭스가 중합되면 각 물방울을 500마이크로리터의 따뜻한 데이 제로에서 3개의 HIO 매체로 덮습니다. 3일차에는 투명한 기저막 매트릭스 액적을 방해하지 않고 각 웰 측면에서 0-3일차 HIO 매체를 조심스럽게 흡인합니다.500마이크로리터의 따뜻한 데이 3-14 HIO 미디어로 교체하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 14일차에는 현미경으로 각 웰을 검사하여 투명한 3D 기저막 매트릭스의 각 방울에서 발달하는 HIO+ENS 구조의 수를 평가합니다. 30마이크로리터의 투명한 기저막 매트릭스를 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 얼음 위에 보관합니다.층류 후드 아래에서 미세한 집게를 사용하여 현탁된 HIO+ENS가 포함된 투명한 3D 기저막 매트릭스 방울을 조심스럽게 제거합니다. 집게를 사용하여 개별 HIO+ENS 구조를 부드럽게 분리하십시오. 가는 집게 또는 입이 넓은 피펫 팁을 사용하여 분리된 각 HIO+ENS 구조를 30마이크로리터의 투명한 기저 멤브레인 매트릭스가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.그런 다음 투명한 기저막 매트릭스에 재현탁된 HIO+ENS의 30마이크로리터 방울을 각 건조 웰의 중앙에 피펫으로 넣습니다. 액적이 중합되면 500마이크로리터의 따뜻하고 신선한 데이 3에서 14개의 HIO+ENS 배지를 각 웰에 추가하고 플레이트를 밤새 배양합니다. 15일째에 중합된 액적을 방해하지 않고 각 웰 측면에서 3-14일째 매체를 조심스럽게 흡인합니다.미디어를 500마이크로리터의 따뜻한 day 15-28 HIO+ENS 미디어로 교체합니다. HIO-ENS 공동 배양은 중간엽 구조의 발달과 함께 상당한 성장을 보였으며, 얇고 흐릿한 돌기를 형성하여 30일까지 상피 인볼루션 주위에 후광과 같은 경계를 형성했습니다. ENCC는 HIO 내에서 GFP 형광으로 나타난 바와 같이 HIO를 향해 이동하고, 중간엽 내에 통합되었으며, 시험관 내에서 생존하여 중간엽에서 적절한 생존 및 분화 신호를 확인했습니다.이식된 HIO+ENS 공동배양은 생체 내 성장 후 HuCD를 포함한 뉴런 마커와 S100 베타와 같은 신경교 마커를 발현하여 뉴런과 신경교세포로의 분화를 확인했습니다.

innervation-of-human-intestinal-organoids

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 먼저 인간 유도 만능 줄기세포를 특수 배지에서 배양하여 스페로이드를 형성한 다음, 특정 억제제를 사용하여 운동 뉴런으로 분화하고, 마지막으로 미세유체 칩으로 배양하여 축삭을 확장하고 운동 신경 오가노이드를 형성하는 방법을 보여줍니다.

미세유체 칩을 이용한 인간 iPSC 유래 운동 신경 오가노이드 개발

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

여기에서는 인간 만능 줄기 세포 유래 소장 및 결장 오가노이드를 생성, 유지 및 특성화하는 자세한 방법에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 재현성을 개선하고, 확장성을 확장하며, 오가노이드의 도금 및 패시징에 필요한 작업 시간을 단축하도록 설계되었습니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 장 및 결장 오가노이드의 생성, 유지 및 특성화

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

이 프로토콜은 인간 장 오가노이드 기술과 단일 세포 전사체 분석을 결합하여 이전에 탐구되지 않은 장 생물학에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

인간 장 오가노이드를 사용하여 단세포 전사 수준에서 소장 상피를 이해합니다.

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

신경 상피 조직의 전례 없는 복잡성으로 인해 인간의 뇌 발달을 모델링하는 데 방해를 받았습니다. 여기에서는 인간 뇌 발달의 초기 사건을 묘사하고 체외에서 소두증을 모델링하기 위해 뇌 오가노이드의 강력한 생성 방법을 설명합니다.

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

배우세요 인간 장내 오가노이드에 장신경계를 통합하는 조직공학 기술을 통해 단장증후군 치료를 위한 생체공학 장기 개발 방법을. 이 연구는 소아 장기능 장애 환자를 위한 혁신적 치료 기반을 제공합니다.

인간 장내 오가노이드(Intestinal Organoids)의 신경 분포(Nervation of Human Intestinal Organoids)

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