해안 습지에서 메탄 순환 미생물 역학 시각화

이 연구는 남부 텍사스 해안 습지에서 주요 메탄 순환 미생물 유전자의 공간적, 시간적 분포를 시각적으로 일치시켰으며, 환경 요인이 메탄 역학을 어떻게 조절하는지 탐구합니다. 우리의 연구 결과는 남부 텍사스 해안 습지의 풍부한 메탄 순환 유전자가 염도와 계절을 포함한 환경 조건에 민감하다는 것을 보여줍니다. 특히 메탄 모노옥시게나제 유전자의 일종인 mmoX는 서늘한 계절에 가장 풍부합니다.

이 프로토콜은 환경 요인의 영향을 받는 공간 및 계절적 미생물 역학을 시각화하는 새로운 도구를 제공함으로써 메탄 순환 미생물 유전자를 검출하는 연구를 다룹니다. 최적화된 PCR 방법을 GIS 시각화와 통합함으로써 이 프로토콜은 환경 요인의 영향을 받는 동적, 공간적, 계절적 미생물 패턴을 포착하는 동시에 메탄 순환 유전자의 향상된 검출 및 공간 매핑을 제공합니다.

[해설자] 시작하려면 eDNA 및 기타 성분과 함께 25마이크로리터 cPCR 반응 혼합물을 준비합니다. 튜브를 PCR 기계에 넣고 적절한 매개변수로 cPCR 반응을 실행합니다. cPCR 후, 주형 DNA를 제외한 사이버 그린을 함유한 qPCR 반응 혼합물을 준비한다. 준비된 반응 혼합물 57마이크로리터를 각 PCR 튜브에 분배합니다. 각 튜브에 3마이크로리터의 템플릿 DNA, 표준 또는 뉴클레아제가 없는 물을 넣고 튜브를 가볍게 두드려 혼합합니다. 각 튜브에서 준비된 반응 혼합물 20마이크로리터를 96웰 qPCR 플레이트의 지정된 웰에 분취합니다. 어플리케이터를 사용하여 접착식 PCR 밀봉 필름으로 PCR 플레이트를 밀봉합니다. 그리고 1,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 적절한 혼합을 보장하고 웰 내의 기포를 제거합니다. PCR 플레이트를 열 순환기에 놓습니다. qPCR 기계를 켜고 관련 소프트웨어를 열어 프로토콜을 설정합니다. qPCR 프로그램을 설정하고 실행을 시작합니다. 지리 정보 시스템 소프트웨어인 ArcGIS Pro를 열고 Study Area라는 이름의 프로젝트 파일을 컴퓨터의 지정된 폴더에 저장합니다. 맵을 클릭한 다음 베이스맵을 선택하고 레이블이 있는 지형을 기본 맵으로 선택합니다. 찾기를 클릭한 다음 검색을 클릭합니다. 검색창이 열리면 지도에서 찾을 연구 영역의 이름을 입력합니다. 지리 참조를 사용하여 특정 영역을 그리려면 보기를 클릭한 다음 상단 레이어에서 카탈로그 창을 클릭합니다. 카탈로그에서 폴더를 두 번 클릭하고 필요한 파일 이름을 선택합니다. 지역 데이터베이스 .gdb 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 새로 만들기를 클릭하고 피쳐 클래스를 선택합니다. 그러면 피쳐 클래스 생성 창이 나타납니다. 이름 및 별칭 상자를 입력하고 하단의 마침을 클릭합니다. 이제 보기를 클릭한 다음 내용을 클릭합니다. 별칭 이름이 콘텐츠 창에 표시됩니다. 최상위 레이어에서 편집을 클릭한 다음 만들기를 클릭합니다. 피처 생성 창이 열립니다. 피처 생성 창에서 별칭을 더블클릭하면 도구 피드백 구성 옵션이 나타납니다. 선을 선택한 다음 지도에서 선을 스케치하여 연구 영역 경계를 작성합니다. 맵을 두 번 클릭하여 완료합니다. GIS 소프트웨어를 최소화하고 스프레드시트를 엽니다. 첫 번째 열에 샘플 이름, 두 번째 열에 위도, 세 번째 열에 경도를 입력합니다. pmoA1, pmoA2, mmoX 및 mcrA의 qPCR 데이터에 대해 다음 4개의 열을 사용합니다. 컴퓨터의 특정 폴더에 파일을 CSV 형식으로 저장합니다. 그런 다음 GIS 소프트웨어를 열고 데이터 추가를 클릭한 다음 XY 포인트 데이터를 클릭합니다. 입력 테이블 상자의 폴더에서 저장된 CSV 파일을 선택합니다. 출력 피처 클래스 상자에서 파일 이름을 바꾸고 실행을 클릭하여 맵에 샘플링 포인트를 표시합니다. 이제 상단의 검색창을 클릭하고 Kriging을 검색합니다. 샘플링 스테이션 파일을 선택하고 pmoA1을 선택합니다. 그런 다음 환경을 클릭하고 레이어와 마스크에서 샘플링 스테이션을 선택한 다음 실행을 클릭합니다. 맵의 레이아웃을 생성하려면 삽입, 새 레이아웃을 클릭하고 ANSI-Landscape를 선택합니다. 맵 프레임을 클릭하고 크리깅이 있는 맵을 선택한 다음 직사각형을 그려 레이아웃에 모든 맵을 배치합니다. 북쪽 화살표를 선택하고 배치에 배치하여 북쪽 방향을 나타냅니다. 그런 다음 축척 막대를 선택하여 맵에 해당 지역의 축척을 표시합니다. 범례를 클릭한 다음 레이아웃에 배치하여 맵 범례를 표시합니다. 그리드를 클릭한 다음 검은색 눈금선 옵션을 선택하여 위도와 경도가 있는 그리드를 만듭니다. 그리드는 콘텐츠 창에 Black Horizontal Label Graticule 레이블과 함께 나타납니다. Black Horizontal Label Graticule을 두 번 클릭하고 Components를 선택한 다음 오른쪽에 있는 십자 기호를 클릭하여 Ticks 1 및 Grid를 제거합니다. 마지막으로 최상위 레이어에서 공유를 클릭한 다음 레이아웃 내보내기를 클릭합니다. 파일 형식을 PDF로 선택하고 이름 상자를 사용하여 컴퓨터에 파일을 저장한 다음 세로 해상도를 500DPI로 설정한 다음 내보내기를 클릭하여 맵의 PDF 파일을 생성합니다. cPCR 분석은 메탄 순환 관련 유전자 검출의 공간적 가변성을 밝혔으며, 모든 LB 및 RV 샘플에서 mcrA 유전자가 검출되었지만 BC 샘플에서는 존재하지 않아 염도와 메탄 생성 물질 분포가 연결되었습니다. cPCR은 A189-mb661 프라이머 쌍이 있는 pmoA1에 대해 더 밝은 밴드를 보여주었고, RV 샘플에서는 낮지만 검출 가능한 풍부도를 확인했지만 LB 및 BC에서는 존재하지 않았습니다. qPCR 분석은 mmoX 유전자가 서늘한 계절에 가장 풍부하고 pmoA1이 따뜻한 계절에 가장 풍부하여 높은 계절적 변화를 보여주었습니다.