생리학적 내강내 압력에서 작은 폐정맥의 Ca²⁺ 신호 이미징

이 프로토콜에서는 생리학적 내강내 압력에서 폐내 정맥(작은 폐정맥 또는 PV)에서 Ca²⁺ 신호를 기록하고 분석하기 위한 새로운 기술을 제시합니다. 이 기술에는 작은 PV를 분리하고, Ca²⁺ 지표로 배양하고, 캐뉼러 및 가압하고, Ca²⁺ 신호의 컨포칼 이미징 및 데이터 분석이 포함됩니다.

칼슘 신호는 혈관 기능을 조절하며, 그 근원과 역할은 다양합니다. 우리는 혈관 벽에서 그들의 특정 기능을 이해하고 질병과 관련된 이상을 식별하는 것을 목표로 합니다. 대부분의 폐 혈관 연구는 폐정맥이 아닌 동맥이나 모세혈관에 초점을 맞춥니다.

정상적인 내강내 압력 하에서 폐정맥의 칼슘 신호에 대한 생리학적 관련성에도 불구하고 칼슘 신호를 조사한 연구는 없습니다. 폐정맥은 심장 순환 주기 동안 압력 변화를 겪지만 칼슘 신호에 미치는 영향은 연구되지 않았습니다. 당사의 프로토콜은 정상 압력에서 작은 폐정맥의 칼슘 신호를 수집하고 자동으로 분석할 수 있습니다.

당사의 프로토콜은 내강내 압력이 작은 폐정맥의 칼슘 신호에 미치는 영향에 대한 향후 연구를 가능하게 하여 건강과 질병에 대한 칼슘 신호의 조절 및 역할에 대한 이해를 증진시킬 수 있습니다. 시작하려면 해부 도구와 접시를 100% 에탄올로 세척한 다음 탈이온수로 세척하십시오. 가위로.

안락사된 쥐의 흉강을 엽니다. 겸자를 사용하여 폐를 최소한으로 건드리지 않고 흉강에서 심장과 폐를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 차가운 HEPES 완충 생리학적 염 용액이 들어 있는 밀봉 가드 코팅판에 조직을 놓습니다.

큰 폐정맥과 폐동맥이 잘 보이도록 해부 핀을 사용하여 심장과 폐를 고정하고 폐의 왼쪽 엽이 약간 늘어나도록 합니다. 큰 폐 정맥을 기준점으로 사용하여 미세한 가위를 사용하여 작은 폐간 정맥을 둘러싼 조직을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 작은 폐정맥을 주변 조직으로부터 부드럽게 분리한다.

다음으로, DMSO를 사용하여 2.5 millimolar Fluo-4 AM의 스톡 농도를 준비합니다. 재고 용액을 사용하여 적재 용액을 준비합니다. 로딩 용액과 함께 1.5ml 튜브에 작은 폐정맥을 넣습니다.

튜브를 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 37도의 수조에서 1시간 동안 배양합니다. 작은 폐 정맥을 캐뉼링하려면 세척액에서 정맥을 제거하십시오. 준비된 압력 근조영실에 놓습니다.

끝이 가는 집게를 사용하여 작은 폐정맥의 한쪽 끝을 캐뉼라 중 하나에 조심스럽게 캐뉼러를 삽입한 다음 나일론 실 마이크로 필라멘트를 사용하여 작은 폐정맥의 캐뉼러 끝과 캐뉼라 끝 부분에 매듭을 묶어 고정합니다. 생리학적 소금 용액을 캐뉼라를 통해 부드럽게 밀어 폐정맥 내부의 혈액을 제거합니다. 나일론 실을 사용하여 마이크로 필라멘트를 사용하여 유리 캐뉼러로 다른 쪽 끝을 묶습니다.

칼슘 이미징의 경우 먼저 HEPES 완충 생리학적 염 용액이 들어 있는 튜브에 서보 압력 컨트롤러를 부착합니다. 컨트롤러를 사용하여 한쪽 끝에서 작은 폐정맥을 가압합니다. 이제 연동 펌프를 입구와 출구 및 출구에 연결하고 용액을 과융합합니다.

평형 기간이 지나면 40x water dipping objective와 spinning disc 컨포칼 이미징 시스템을 사용하여 1, 000 프레임에 대한 칼슘 이미지를 획득합니다. 이미지 분석을 수행하려면 맞춤형으로 설계된 Spark 및 소프트웨어를 실행합니다. 5 x 5 필터와 중앙값 필터를 사용하여 이미지를 매끄럽게 한 다음, 이벤트 자동 감지를 위해 여러 셀이 있는 폐정맥의 평평한 영역을 설명하는 프레임을 사용합니다.

보기 및 Event Auto Detection을 클릭합니다. 이벤트 임계값을 F0에 대해 1.3F의 진폭으로 설정하고, 허용 오차를 20%로, 스캔 상자를 7 x 7픽셀로, 실행 평균을 7개의 이미지로 설정합니다. 검색 시작 또는 눈 아이콘을 클릭합니다.

보기 메뉴에서 small events 테이블을 클릭하여 이벤트 테이블을 찾은 다음, 감지된 칼슘 이온 신호의 수를 선택한 프레임의 영역으로 나누어 마이크로미터 제곱당 이벤트를 계산합니다. 수은 내강내 압력이 5mm일 때 작은 폐정맥에서 자발적으로 발생하는 칼슘 신호의 수는 기저 조건에서 제곱마이크로미터당 분당 0.73회 ±0.2회였습니다. 리아노딘의 첨가는 칼슘 신호 전달 활성을 크게 감소시켰습니다.