CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

여기에서는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 모기 A. aegypti 에서 배아 미세주입을 통한 게놈 편집을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

우리 연구 범위에는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 유전자 변형 모기 계통을 확립하는 것이 포함됩니다. 모기 개체군 억제, PgSIT를 위한 CRISPR-Cas9 기술의 사용과 유전자 발현의 시공간적 제어를 위한 이진 발현 시스템 구축.

우리는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 녹아웃 및 노킨 라인을 모두 얻었습니다. 당사의 녹킨 라인에는 조직 특이적 표지 및 신경 활동 리포터인 G-CaMP6를 위한 형광 마커, GFP와 같은 다운스트림 유전자의 시공간적 제어를 가능하게 하는 QF 트랜스액티베이터의 삽입이 포함됩니다.

새로운 모기 돌연변이 계통의 확립은 유전자 기능과 신경, 생리학적, 행동적 의미에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 할 것입니다. 이는 모기 매개 질병 전파를 예방하는 새로운 방법의 개발로 이어질 수 있습니다. 우리 연구실은 CRISPR-Cas9 기술에 의존하여 남성 생식력 및 여성 생존력과 관련된 유전자를 녹아웃하는 모기 개체수 억제 기술을 개발했습니다. 또한 우리는 모기의 감각 저항성, 특히 후각과 시각을 연구하기 위해 여러 모기 계통을 설정했습니다.

[면접관] 녹아웃 돌연변이를 위한 주입 구조물을 준비하려면 Cas9 희석 완충액을 사용하여 Cas9 단백질을 원하는 농도로 희석합니다. 그런 다음 시험관 내 합성 가이드 RNA 또는 gRNA의 분취량을 초순수로 희석합니다. 희석된 Cas9 단백질을 각 gRNA와 미리 혼합하여 리보핵단백질 복합체를 형성합니다. 그런 다음 미리 혼합된 여러 개의 리보핵단백질 복합체 용액을 결합합니다. 상동성 지향 복구 매개 유전자 카세트 삽입의 경우 Cas9 단백질과 gRNA를 희석하고 혼합합니다. 기증자 플라스미드를 초순수로 희석하고 모든 구조물을 결합합니다. 다음으로 석영 필라멘트를 사용하여 미세 주입 바늘을 준비합니다. 다음 프로그램을 사용합니다. 레이저 마이크로피펫 풀러로 바늘을 당깁니다. 수동 흡인기를 설치한 후 흰색 원형 여과지를 적셔 내벽이나 수집기 내부의 축축한 면 위에 놓습니다. 5-10일 전에 피를 먹인 암컷 모기 5-10마리를 수집기에 넣습니다. 그런 다음 수집기를 어둠 속에 45분 동안 두십시오. 그런 다음 수집기에서 모기를 제거하십시오. 배양 후 여과지를 제거하여 배아를 수확합니다. 수확 용지에서 밝은 회색인 배반엽 전 단계 배아를 선택합니다. 젖은 브러시로 선택한 배아를 커버 슬립 위에 놓인 양면 접착 테이프에 옮깁니다. 배아를 평행하게 정렬하여 주변이 젖은 상태로 유지되는 동안 모든 뒤쪽 끝이 앞쪽을 향하도록 나란히 있는지 확인합니다. 정렬하는 동안 건조를 방지하기 위해 배아에 할로카본 오일 700을 첨가하십시오. 마이크로인젝터에서 300헥토파스칼의 보상 압력과 500헥토파스칼의 주입 압력을 설정합니다. 마이크로 로더를 사용하여 3마이크로리터의 주입 구조물을 바늘에 넣습니다. 정렬된 배아가 있는 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 놓고 주입을 위해 현미경 아래에 놓습니다. 다음으로, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 배아의 뒤쪽 끝을 향해 10도 각도로 바늘을 바늘 홀더에 고정합니다. 바늘 끝을 커버 슬립의 가장자리에 가볍게 대고 바늘을 부드럽게 엽니다. 그런 다음 배아에 플라스미드 구조물을 주입합니다. Aedes agyptie 모기에 주사 구조물을 주입한 후 보푸라기가 없는 일회용 물티슈를 사용하여 배아 주변의 기름을 제거합니다. 탈이온수를 첨가하여 배아를 헹굽니다. 헹군 배아를 젖은 여과지에 옮기고 여과지를 캐럿 9온스 컵 안의 젖은 티슈 위에 놓습니다. 그런 다음 젖은 면을 컵 바닥에 놓아 수분을 유지합니다. 배아를 3-4일 동안 촉촉하게 유지한 후, 부화를 위해 배아가 담긴 여과지를 Sterilite 6쿼트 팬에 담긴 약 3리터의 탈이온수에 옮깁니다. G 제로 유충이 부화하면 물과 섞인 생선 먹이를 팬에 넣습니다. 3령에서 4령 유충 단계에서 형광 마커에 대한 G 제로 유충을 스크리닝합니다. 형광 상태에 따라 유충을 분리합니다. 형광 양성 및 형광 음성 유충을 별도의 팬에 유지합니다. 번데기가 될 때 주사된 모기를 성별에 따라 분리하고 더 작은 크기, 더 두드러지고 뾰족한 생식기 엽, 더 넓은 패들로 수컷을 식별합니다. 더 큰 크기, 덜 뚜렷한 생식기 엽, 더 좁은 패들로 암컷을 식별하십시오. 각 성별의 형광 양성 또는 형광 음성 모기를 풀링한 후, 각 풀을 야생형 리버풀 A. agyptie 균주의 이성 모기와 형광 스크리닝된 개체당 3-5마리의 비율로 교배하여 4일 동안 짝짓기를 할 수 있습니다. 3-4일 후, G1 유충을 3-4령 유병 단계에서 형광 마커에 대해 스크리닝합니다.