Name: 토끼 근육에서 육-소포체 Ca2+-ATPase의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 토끼 근육에서 트레할로스를 활용한 SERCA 정제 방법을. 초고속 원심분리와 원형 이색성 분석을 통해 90% 이상의 순도와 높은 촉매 활성을 확보하는 이 기법은 구조생물학 연구에 필수적입니다.

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모든 동물 절차는 실험 실험실에서의 동물 취급에 대한 국제 및 지역(NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) 지침 51,67,68에 따라 수행되었습니다. 근육 조직은 지역 동물 취급 장치(INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46의 야생형 Oryctolagus cuniculus에서 얻었습니다. 실험실 동물 관리에 대한 전문 지식을 갖춘 수의사가 초기 근육 절제 및 처리를 수행했습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 빠르게 움직이는 토끼 근육에서 근체망체의 분리(타이밍, 7 - 9시간)
참고: 절차에 대한 자세한 내용은 Champeil et al.69를 참조하십시오.
<ol>
	<li>야생형 Oryctolagus cuniculus에서 속경 근육 조직(동물당 양쪽 뒷다리에서 ~70g)을 얻습니다. 참고: 절개할 근육에 대한 사전 육안 식별이 필요합니다70,71.</li>
	<li>빠르게 움직이는 근육을 믹서기에 100mM KCl의 3 볼륨으로 매달아 1 분 및 1 분 얼음처럼 차가운 휴식으로 3 회 반복72.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 원심분리(1500 × g)로 조직 파편을 제거합니다. 필요한 경우 두 번째 원심분리(4200 × g)를 수행합니다.</li>
	<li>상등액을 수집하고 조직 분쇄기(저속, 즉 500-1,500rpm에서 10회 스트로크)를 사용하여 균질화합니다.72,73. 균질액(10,000 × g)을 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 알림: 상대적으로 높은 속도를 사용하면 시스템과 작업자가 손상될 수 있으므로 균질화할 때 주의해야 합니다.</li>
	<li>상층액(근소포체 함유)(33,000 × g)을 4°C에서 120분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>펠릿을 40mL의 수크로오스 0.5mL와 원심분리기(12,000× g)에 4°C에서 15분 동안 현탁합니다. 상층액(0.6 M KCl 및 0.15 M 자당)을 희석하고 현탁액(34,000 × g)을 4°C에서 165분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>근질망 소포체(SRV) 시트를 포함하는 펠릿을 0.3M의 자당, 0.1M의 KCl 및 5mM의 Tris-HCl, pH 7.0에 현탁합니다. Lowry assay74 및 인간 혈청 알부민을 단백질 표준물질로 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.</li>
	<li>SRV(30-32 mg/mL)를 1 mL 용량으로 분주합니다. 추가 처리를 위해 SRV 샘플을 -72°C에서 보관하십시오. 참고: 단백질 수율은 동물당 100-110mg SRV입니다.</li>
</ol>
2. SERCA 정화 (타이밍, 18 - 20 시간)
참고: 절차에 대한 자세한 내용은 Rivera-Morán et al.46을 참조하십시오.
<ol>
	<li>얼음처럼 차가운 75mM의 Tris-HCl, pH 7.2, 0.6M의 KCl, 6mM의 EDTA, 1mM의 EGTA 및 0.1%(w/v) 데옥시콜레이트(DOC)를 사용하여 SRV 현탁액을 2mg protein/mL로 희석합니다. SRV 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양하고 부드럽게 교반합니다. SRV 현탁액(100,000 × g)을 4°C에서 60분 동안 원심분리기합니다. 참고: DOC는 한 방울씩 추가해야 합니다.</li>
	<li>25mM의 Tris-HCl, pH 7.5, 0.3M의 KCl, 45% 글리세롤(v/v) 및 2mM EDTA &lt;3mL에 펠릿을 현탁시킵니다. 현탁액을 균질화하고 최종 부피 10mL로 조정합니다. 단백질 농도를 측정한 다음 6.5mg/mL로 조정합니다. 5 mg/mL 및 0.85 (w/w) Zwittergent 3-14에서 아졸렉틴을 추가합니다. 참고: Azolectin과 Zwittergent 3-14는 한 방울씩 추가해야 합니다.</li>
	<li>현탁액과 원심분리기(100,000 × g)를 4°C에서 60분 동안 균질화합니다. 상층액을 모아 2mM의 EGTA(pH 7.2)로 1:2로 희석합니다.</li>
	<li>10mM의 Tris-HCl, pH 7.0, 1mM의 EDTA, 0.1% 데옥시콜레이트 및 1mg/mL의 아졸렉틴에서 불연속 트레할로스 농도 구배(45, 40, 35 및 30% w/v)에 현탁액을 부드럽게 붓습니다. 원심분리기(100,000 × g) 4°C에서 14시간 동안. 튜브 바닥에 형성된 투명하고 약간 황색을 띤 펠릿을 수집합니다. 참고: 트레할로스 구배의 형성과 샘플 현탁액의 추가는 모두 적절한 기술을 사용하여 수행해야 합니다. 하룻밤 동안 원심분리하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>Tris-HCl 25mM, pH 7.5, M KCl 0.3, 글리세롤 45% 및 EDTA 2mM의 소량(&lt;1.5mL)으로 펠릿을 부드럽게 현탁시킵니다. 단백질 농도를 측정합니다. 단백질 농도를 2mg/mL로 희석하여 조정합니다. 현탁액의 부분 표본(~50 μL)을 취하고 정제된 SERCA를 사용할 때까지 -72 °C에서 보관합니다.</li>
	<li>정제된 SERCA72 및 다양한 정제 단계에서 채취한 단백질 샘플의 SDS-PAGE를 수행합니다. Coomassie Blue72로 젤을 염색합니다. 참고: 현탁액에 글리세롤 대신 0.6M 트레할로스를 사용하면 저장 및 동결-해동 주기 동안 효소의 안정성이 증가합니다28,29.</li>
</ol>
3. ATPase 활성에 대한 분석 (타이밍, 1 - 2 시간)
<ol>
	<li>효소 결합 분석법: ATPase-Piruvate kinase-lactate dehydrogenase<ol>
		<li>반응 혼합물 (1 mL)을 준비합니다 : 50 mM MOPS (pH 7.0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM 포스포에놀피루베이트, 250 μM NADH. 다양한 ATP 농도(0.001 - 0.25mM)를 포함합니다.</li>
		<li>와류(vortexing)에 의한 반응 분석을 조심스럽게 균질화합니다. 반응 분석을 37°C에서 10분 동안 배양하고 0.9U L-젖산 탈수소효소(LDH) 및 1.5U 피루브산 키나아제(PK)를 추가합니다.</li>
		<li>SERCA 10μg을 첨가하여 ATPase 반응을 시작합니다.</li>
		<li>NADH의 형성을 결정합니다. 온도 조절 셀 홀더가 있는 분광 광도계를 사용하여 시간이 지남에 따라 340nm의 파장(λ)에서 600초 동안 초당 흡광도 강도의 변화를 따릅니다. 참고: 흡광도 측정을 위한 시간 간격은 다를 수 있지만 ATPase 반응의 초기 직선을 그리려면 가능한 한 많은 데이터 포인트를 기록하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ATP 가수분해 속도 측정 참고: 절차에 대한 자세한 내용은 Rivera-Morán et al.46을 참조하십시오.<ol>
		<li>형성된 각 곡선에서 선형 부분의 기울기 값(Δabs/min)을 계산합니다. NADH(λ = 6,220 M−1·cm−1)의 몰 흡광 계수(ε)를 사용하여 ATPase 활성(μmoles ATP 가수분해/min.mg prot)을 측정합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>동역학 매개변수 K, m 및 Vmax 결정
	<ol>
		<li>데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 속도 대 ATP 농도를 플롯합니다.</li>
		<li>비선형 회귀를 통해 데이터를 Michaelis-Menten 방정식(식 1)46에 맞춥니다. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67748/67748eq01.jpg" style="margin: auto;"> 여기서 v 는 속도, Vmax 는 최대 속도, [S]는 ATP 농도, Km 은 Michaelis-Menten 상수입니다.</li>
		<li>반복을 통해 Km 및 Vmax 를 결정합니다. 참고: DOC를 포함하면 ATPase 속도 반응이 증가할 수 있습니다. 최적을 찾기 위해 DOC의 다양한 농도를 테스트하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. FITC(Fluorescein Isothiocyanate)를 사용한 SERCA의 라벨링 분석(타이밍, 30 - 45분, FITC 라벨링에만 해당)
참고: 절차에 대한 자세한 내용은 54,75,76을 참조하십시오.
<ol>
	<li>1mM의 FITC를 포함하는 50mM의 라벨링 버퍼(100mM KCl, 5mM MgCl2 및 30mM Tris-HCl, pH 8.9)의 50μL(최종 부피)에 SERCA(20μg)를 현탁합니다. 소용돌이에 의하여 섞으십시오.</li>
	<li>어두운 곳과 실온에서 서로 다른 시간(15분, 10분, 7분, 5분, 2분)에 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>ATP(5mM)를 포함하는 1부피의 얼음-저온 정지 완충액(480mM의 자당 및 48mM의 MOPS, pH 7.0)을 첨가하여 라벨링 반응을 중지합니다. 어둠 속에서 5분 동안 얼음 위에서 배양합니다.</li>
	<li>FITC 라벨이 붙은 SERCA에 SDS-PAGE72를 적용한다. 투명 젤을 자외선(λ = 302nm)에 노출시킵니다. 결과를 사진으로 문서화합니다.</li>
	<li>쿠마시 블루로 젤을 염색합니다. 결과를 사진으로 문서화합니다. 참고: 어두운 방에서 FITC 라벨링을 수행하면 형광 신호의 품질이 향상될 수 있습니다.</li>
</ol>
5. 원형 이색성(CD) 스펙트럼(타이밍, 30분)
참고: 절차에 대한 자세한 내용은11,77을 참조하십시오.
<ol>
	<li>25°C에서 400μL의 10mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 SERCA(3μM)를 현탁합니다.</li>
	<li>0.1cm 경로 길이 셀에 샘플을 로드합니다. 원자외선 스펙트럼 λ 범위를 190-260nm 사이로 설정합니다. 내부 해상도와 대역폭을 1nm로 설정합니다.</li>
	<li>25°C에서 50nm/min으로 CD 신호를 기록합니다.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>대두에서 추출한 아졸렉틴</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>44924</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 UV 투과광기&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-97623-08</td><td>이중 강도 높은 설정은 분석 문서화에 이상적입니다. 낮은 설정은 준비 작업을 수행하는 동안 겔 샘플의 광염색 또는 광표백을 줄입니다.</td></tr><tr><td>CaCl2 & 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Coolpix B500 카메라&nbsp;</td><td>Nikon Corp</td><td>S210</td><td></td></tr><tr><td>쿠마시 브릴리언트 블루 G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610406</td><td></td></tr><tr><td>도데실 말토사이드</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N&프라임;,N&프라임; -테트라아세트산</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 테트라나트륨염 이수화물&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 & 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>230</td><td></td></tr><tr><td>N-tetradecyl-N,N- 디메틸-3-암모늄-1-프로판술폰산염</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D0431</td><td></td></tr><tr><td>포스포에놀피루베이트(PEP)</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>9711</td><td></td></tr><tr><td>토끼 근육 젖산 탈수소효소</td><td>Roche</td><td>10003557103</td><td></td></tr><tr><td>토끼 근육 피루브산 키나아제</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>데옥시콜레이트 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>도데실 황산나트륨</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td></td></tr><tr><td>분광 편광계&nbsp;</td><td>자스코 주식회사</td><td>자스코 J1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마-알드리치 주식회사</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>트레할로스</td><td>시그마-알드리치 주식회사</td><td>T0167</td><td>이수화물</td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염</td><td>시그마-알드리치 주식회사</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS 분광 광도계&nbsp;</td><td>애질런트 테크놀로지</td>스 <td>8453</td><td>애질런트 8453 UV-Vis 분광 광도계는 포토다이오드 어레이를 사용하여 자외선에서 가시광선 스펙트럼까지 전체 스펙트럼을 동시에 측정합니다</td></tr><tr>.<td>WiseStir HS-30E</td><td>Daihan Scientific Co.</td><td>DH입니다. WOS01010</td><td>티슈 그라인더용으로 설계된 모든 분산 및 균질화 응용 분야에 이상적입니다.</td></tr></tbody></table>

토끼 근육에서 육-소포체 ca2+-atpase의 정제

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

다양한 정제 단계에서 SERCA의 SDS-PAGE(그림 1). Coomassie 파란색 염색 겔은 정제 프로토콜이 진행됨에 따라 SERCA 단백질 밴드(겉보기 분자량 &gt;100kDa)가 풍부해지는 것을 보여줍니다. SERCA에 해당하는 단백질 밴드는 트레할로스 농도 구배에서 원심분리 후 &gt;90%의 순도를 보여줍니다. ATP 가수분해 속도 대 ATP 농도의 플롯(그림 2A). 정제된 SERCA에 대해 Michaelis-Menten ATPase kinetic(쌍곡선 패턴)이 관찰됩니다. 그림 2A에 있는 데이터의 Lineweaver-Burk 플롯(그림 2B). 플롯에서 SERCA(10μM)에 대한 Km 값은 x-절편(...

토끼 근육에서 육-소포체 Ca2+-ATPase의 정제

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