토끼 근육에서 육-소포체 Ca²⁺-ATPase의 정제

우리의 연구는 높은 구조적 품질과 촉매 활성으로 SERCA를 정제하는 동시에 트레할로스가 정제 중에 SERCA를 안정화하여 안정성과 기능성을 향상시키는지 여부를 조사하는 데 중점을 두고 있습니다. 올리고머 상태에서 P형 ATPase의 3차원 구조 결정. ATPase 구조 모델링, 구조 역학 시뮬레이션 및 리간드의 분자 도킹을 위한 인공 지능을 사용하여 질병 치료법을 탐색하고 단백질 기능 분석 및 최신 기술을 개선합니다. 현재 과제에는 P-ATPase의 에너지 변환 메커니즘을 이해하고, 4차 구조가 기능과 활성을 조절하는 방법을 밝히고, 인간 질병에 대한 치료 적용을 위한 효과적인 억제제를 식별하는 것이 포함됩니다. 우리는 GS 원형질막 양성자-ATPase의 육량체 상태를 확인하고 Kramers의 이론에 의해 설명된 구조 역학 의존성 또는 중간 점도를 입증합니다.

[해설자] 시작하려면 야생형 Oryctolagus cuniculus에서 속근을 얻으십시오. 침용을 위해 100밀리몰 염화칼륨 3부피에 현탁시킵니다. 1분 동안 블렌딩한 후 1분 동안 얼음처럼 차갑게 휴식을 취합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 1,500g에서 5분 동안 원심분리하여 조직 파편을 제거합니다. 상청액을 튜브에 모은 다음 티슈 그라인더로 균질화합니다. 다음으로, 균질을 원심분리한 다음 상층액을 원심분리합니다. 약 40밀리리터의 0.5몰 자당에 펠릿을 현탁합니다. 이제 현탁액을 섭씨 4도에서 12,000g에서 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리하기 전에 생성된 상청액을 0.6몰 염화칼륨과 0.15몰 자당으로 희석합니다. 근질 소포 시트를 함유한 펠릿을 pH 7.0에서 0.3몰 자당, 0.1몰 염화칼륨 및 5밀리몰 트리스-염산염을 함유하는 완충액에 현탁합니다. 근포질 소포를 1밀리리터 부피로 분취합니다. 근형질 소포 소포 현탁액을 얼음 위에서 부드럽게 교반하면서 10분 동안 배양한 다음 원심분리합니다. 펠릿을 3밀리리터 미만의 25밀리몰 트리스-염산염 완충액에 현탁시킵니다. 현탁액을 균질화한 후 Tris-염산염 완충액으로 최종 부피 10밀리리터로 조정합니다. Lowry 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 밀리리터당 5mg의 아졸렉틴을 첨가한 다음 0.85 Zwittergent 3-14를 첨가합니다. 현탁액을 다시 균질화하고 섭씨 4도에서 100,000g에서 60분 동안 원심분리합니다. 새 튜브에 상청액을 수집합니다. pH 7.2에서 2밀리몰 EGTA로 1:2 비율로 희석합니다. 현탁액을 Tris 완충액의 불연속적인 트레할로스 농도 구배에 부드럽게 붓습니다. 그런 다음 이전과 같이 원심분리하고 투명하고 약간 노란색 펠릿을 수집합니다. 펠릿을 소량의 Tris 완충액에 부드럽게 현탁합니다. 단백질 농도를 측정한 다음 희석하여 단백질 농도를 밀리리터당 2mg으로 조정합니다. ATPase 활성의 경우 반응 혼합물 1밀리리터를 준비합니다. 반응 분석을 균질화하기 위해 소용돌이치는 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. L-젖산 탈수소효소 0.9 단위와 피루브산 키나아제 1.5 단위를 첨가합니다. 10마이크로그램의 SERCA를 첨가하여 ATPase 반응을 시작합니다. NAD의 형성을 결정하기 위해 온도 조절 셀 홀더가 있는 분광 광도계를 사용하여 340나노미터에서 600초 동안 초당 흡광도 변화를 모니터링합니다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 사용한 SERCA의 라벨링 분석을 위해 먼저 20마이크로그램의 SERCA를 50마이크로리터의 라벨링 완충액에 현탁시킵니다. 소용돌이가 잘 섞여 있습니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 15, 10, 7, 5 및 2분 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 표지 반응을 중지하려면 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 정지 완충액을 추가합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. FITC 레이블이 지정된 SERCA를 SDS-PAGE에 적용합니다. 투명 젤을 302나노미터 파장의 자외선에 노출시키고 결과를 사진 문서화합니다. 마지막으로 젤을 쿠마시 블루로 염색합니다. 결과를 사진으로 기록합니다. 원형 이색성 스펙트럼 분석을 위해 먼저 섭씨 25도에서 pH 7.0의 10밀리몰 인산염 완충액 400마이크로리터에 SERCA를 현탁시킵니다. 경로 길이가 0.1cm인 셀에 샘플을 로드합니다. 이제 원자외선 스펙트럼 범위를 190에서 260나노미터 사이로 설정하고 내부 해상도와 대역폭을 1나노미터로 설정합니다. 섭씨 25도에서 분당 50나노미터의 속도로 원형 이색성 신호를 기록합니다. 쿠마시 블루 염색 SDS-PAGE 겔은 정제가 진행됨에 따라 SERCA 단백질 밴드의 농축을 입증했습니다. 트레할로스 농도 구배에서 초원심분리를 사용한 최종 SERCA 정제 단계에서는 순도가 90%를 초과했습니다. 근포질 소포에는 다량의 SERCA가 포함되어 있으며, 소포 내 총 단백질의 약 73%가 이 P-ATPase에 해당합니다. ATP 가수분해 속도 대 ATP 농도 곡선에서 정제된 SERCA에 대해 Michaelis-Menten 동역학 패턴이 관찰되어 효소 기능이 확인되었습니다. Lineweaver-Burk 플롯은 이전에 보고된 값과 일치하는 ATP에 대해 약 10마이크로몰의 Michaelis 상수를 밝혔습니다. SERCA의 FITC 표지는 온전한 뉴클레오티드 결합 부위를 나타냈습니다. 쿠마시 블루 스테인드 SERCA 밴드는 FITC 라벨이 붙은 밴드와 정확히 일치했습니다. 원형 이색성 분광법은 정제된 SERCA의 높은 구조적 품질을 확인했으며, 그 스펙트럼은 잘 정의된 2차 구조 요소를 나타냅니다.