2025년 4월 11일
이 연구는 형광 신호가 보존된 상태에서 세척된 전뇌 및 척수 샘플을 추출 및 준비하여 실험 효율성과 데이터 무결성을 향상시켜 신경 과학 연구를 발전시키는 프로토콜을 제시합니다.
우리의 연구는 중추 신경계가 인지 기능을 매개하고 면역 체계와 상호 작용하는 방법에 중점을 둡니다. 우리는 뇌와 척수를 검사하는 방법을 개선하여 이러한 상호 작용에 대한 근본적인 질문을 해결하는 것을 목표로 합니다. 이러한 방법은 전체 뇌와 척수를 손상되지 않은 상태로 유지하므로 조직 제거를 사용하여 세포를 보다 철저하게 매핑하는 데 도움이 됩니다. 또한 프로세스를 더 빠르고 정확하게 만들어 기존의 절편 및 이미징 방법에 비해 시간과 실수를 줄일 수 있습니다.
우리는 뇌와 폐에 연결된 척수 영역을 매핑하여 산출했습니다. 우리의 연구는 뇌, 척수 및 폐 사이의 신경 면역 통신을 탐구하는 데 중점을 둘 것입니다. 그리고 이 상호 작용이 면역 반응에 어떤 영향을 미치는지.
[강사] 시작하려면 강철 클램프를 사용하여 마우스의 팔다리를 넓은 아크릴 보드에 고정합니다. 가위를 사용하여 두 대퇴골 사이의 피부를 자르고 횡격막에 도달할 때까지 위쪽으로 계속 자릅니다. 가위와 직선 겸자를 사용하여 횡격막을 통해 흉부의 양쪽을 열어 심장을 노출시킵니다. 관류관에 부착된 0.7mm 주입 바늘을 좌심실에 삽입하고 우심방이에 1-2mm 절개합니다. 관류 후 안과용 가위를 사용하여 마우스의 등과 머리의 피부를 분리합니다. 양쪽 사지의 위쪽 뒤쪽 가장자리를 연결하는 선이 척추와 교차하는 지점에서 척추를 절단합니다. 쥐의 목과 등에서 근육과 지방 조직을 제거하여 척추와 두개골을 노출시킵니다. 정맥 가위로 척추관 하단에서 척추의 좌우와 척수 사이의 정중선 간격을 따라 자릅니다. 그런 다음 절단된 척추의 윗부분과 양측을 제거하여 척수를 노출시킵니다. 뇌 연결에 도달할 때까지 단계를 반복합니다. 정맥 가위의 한쪽 날의 끝을 대구공과 뇌 사이에 놓습니다. 중시상 봉합사를 따라 밀고 절단하여 두개골을 엽니다. 집게를 사용하여 두개골을 제거하고 뇌를 노출시킵니다. 이제 겸자와 정맥 가위를 사용하여 두개골 말단에서 마우스 뇌 척수 조직을 제거합니다. 해부 겸자를 사용하여 실체 현미경 아래에서 척수막을 제거합니다. 그런 다음 봉합사를 사용하여 뇌 척수 샘플을 고정판에 고정합니다. 4% 파라포름알데히드의 샘플 부피의 최소 20배를 추가합니다. 고정 후 파라포름알데히드를 버리고 샘플을 PBS로 세 번 세척합니다. 시작하려면 추출한 마우스 뇌 척수를 파라포름알데히드에 고정합니다. 지질 제거 용액의 경우 용액 A와 B를 질량비를 9:1로 혼합합니다. 50밀리리터의 지질 제거 용액을 50밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고 고정된 조직을 그 안에 넣습니다. 용액 C에서 배양한 후, 용액을 교체하고 샘플을 용액 C에 완전히 담근 배양 접시를 스케일 라인이 있는 라이트 박스에 놓습니다. 겔 용액을 준비하려면 200밀리리터 유리병에 용액 C 147g과 아가로스 3g을 첨가합니다. 교반봉으로 성분을 잘 섞은 다음 아가로스가 녹을 때까지 전자레인지에 돌립니다. 젤 용액을 섭씨 37도로 설정된 실험실 오븐으로 옮깁니다. 섭씨 37도의 템퍼링 젤 용액을 2mm 깊이로 틀에 붓고 섭씨 4도의 냉장고에서 반고체가 될 때까지 30분 동안 식힙니다. 굴절률이 일치하는 샘플을 금형에 넣고 젤 용액을 샘플 상단 높이 또는 약간 아래에 추가합니다. 틀을 섭씨 4도의 냉장고에 다시 넣어 2시간 동안 굽습니다. 뚜껑 슬립으로 덮고 다시 냉장 보관하십시오. 핀셋으로 커버 슬립을 제거하고 내장된 샘플을 꺼냅니다. 30밀리리터 튜브에 50밀리리터의 이미징 용액을 넣고 샘플을 용액에 담급니다. 502 접착제를 도포하여 샘플을 샘플 홀더에 단단히 부착한 후 홀더를 이미징 장치에 고정합니다. 스캔 소프트웨어를 실행하고 배율 섹션에서 4X 배율 수준을 선택합니다. 보정 버튼을 클릭하여 보정 모드를 활성화합니다. 미리보기 버튼을 클릭하여 미리보기 모드로 들어갑니다. 그런 다음 Z 방향 이동 버튼을 클릭하여 생성된 라이트 시트가 샘플을 통과할 때까지 샘플 챔버 바닥에서 위쪽으로 천천히 이동합니다. 적절한 레이저 채널 및 조명 모드 옵션을 선택합니다. 샘플의 스캔 경로 방향을 선택합니다. 자동 스캔 버튼을 클릭하여 샘플의 이미지 캡처를 시작합니다. 이 프로토콜은 선명한 이미징을 위해 온전한 형광 신호를 유지하면서 전체 마우스 뇌와 척수를 성공적으로 보존했습니다. 뇌 척수 샘플의 형광 영상은 상세한 신경 구조를 명확하게 시각화했습니다. 더 높은 배율 이미지는 개별 형광 표지 세포의 향상된 시각화를 제공했습니다.
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본 연구는 형광 신호를 유지하면서 뇌 및 척수 전체 샘플을 추출하고 준비하는 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 실험 효율성을 향상하고 데이터 무결성을 유지하여 신경 과학 연구를 발전시킵니다. 개발된 방법은 기존의 절편화 및 영상 기술보다 더 빠르고 정확한 대안을 제공합니다.
Preserving intact brain-spinal cord connectivity through advanced tissue clearing enables comprehensive mapping of neural and immune interactions, addressing a critical bottleneck in CNS target validation. This protocol streamlines sample preparation and imaging, reducing manual error and accelerating data acquisition for early discovery and translational research. Enhanced imaging fidelity supports predictive confidence in mechanistic studies and portfolio triage for neuroimmunology programs.
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting lead identification and mechanistic studies in neuroimmunology.