Name: 암세포에서 비암호화 RNA 간의 합성 치사 상호작용을 표적으로 하기 위한 이중 CRISPR-간섭 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 학습하세요 이중 CRISPRi 시스템을 활용한 흑색종 세포에서 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 조합적 유전자 녹다운 방법을. 이 기술은 암 특이적 lncRNA 상호작용을 식별하여 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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<ol><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Szcześniak, M. W., Wanowska, E., Mukherjee, N., Ohler, U., Makałowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+deeper+annotation+of+human+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Gene+Regul+Mech%22%5BJournal%5D)">Towards a deeper annotation of human lncRNAs.</a> Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 1863 (4), 194385(2020).</li>
<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NONCODEV5%3A+a+comprehensive+annotation+database+for+long+non-coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs.</a> Nucl Acids Res. 46 (D1), D308-D314 (2018).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+lncRNAs+contributed+critically+to+human+evolution+by+distinctly+regulating+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human-specific lncRNAs contributed critically to human evolution by distinctly regulating gene expression.</a> eLife. 12, RP89001.2(2023).</li>
<li>Sarropoulos, I., Marin, R., Cardoso-Moreira, M., Kaessmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dynamics+of+lncRNAs+across+mammalian+organs+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental dynamics of lncRNAs across mammalian organs and species.</a> Nature. 571 (7766), 510-514 (2019).</li>
<li>Melé, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genomics.+The+human+transcriptome+across+tissues+and+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human genomics. The human transcriptome across tissues and individuals.</a> Science. 348 (6235), 660-665 (2015).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Liu, S. J., Dang, H. X., Lim, D. A., Feng, F. Y., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs in cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 21 (7), 446-460 (2021).</li>
<li>Ahmad, M., Weiswald, L. B., Poulain, L., Denoyelle, C., Meryet-Figuiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+lncRNAs+in+cancer+cells+migration%2C+invasion+and+metastasis%3A+cytoskeleton+and+ECM+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of lncRNAs in cancer cells migration, invasion and metastasis: cytoskeleton and ECM crosstalk.</a> J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 173(2023).</li>
<li>Jain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncPRESS1+Is+a+p53-Regulated+LncRNA+that+Safeguards+Pluripotency+by+Disrupting+SIRT6-Mediated+De-acetylation+of+Histone+H3K56%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LncPRESS1 Is a p53-Regulated LncRNA that Safeguards Pluripotency by Disrupting SIRT6-Mediated De-acetylation of Histone H3K56.</a> Mol Cell. 64 (5), 967-981 (2016).</li>
<li>Bergmann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ESC+transcriptome+by+nuclear+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ESC transcriptome by nuclear long noncoding RNAs.</a> Genome Res. 25 (9), 1336-1346 (2015).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LincRNA-p21+suppresses+target+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LincRNA-p21 suppresses target mRNA translation.</a> Mol Cell. 47 (4), 648-655 (2012).</li>
<li>Huarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+lncRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging role of lncRNAs in cancer.</a> Nat Med. 21 (11), 1253-1261 (2015).</li>
<li>Badowski, C., He, B., Garmire, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-derived+lncRNAs+as+biomarkers+for+cancer+diagnosis%3A+the+Good%2C+the+Bad+and+the+Beauty%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blood-derived lncRNAs as biomarkers for cancer diagnosis: the Good, the Bad and the Beauty.</a> NPJ Precis Oncol. 6 (1), 40(2022).</li>
<li>Zong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+nuclear-retained+long+noncoding+RNAs+using+modified+DNA+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Knockdown of nuclear-retained long noncoding RNAs using modified DNA antisense oligonucleotides.</a> Meth Mol Biol. 1262, 321-331 (2015).</li>
<li>Gagnon, K. T., Li, L., Chu, Y., Janowski, B. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+factors+are+present+and+active+in+human+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RNAi factors are present and active in human cell nuclei.</a> Cell Rep. 6 (1), 211-221 (2014).</li>
<li>Zeng, Y., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+human+cells+is+restricted+to+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm.</a> RNA. 8 (7), 855-860 (2002).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+noncoding+RNA+editing+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated noncoding RNA editing in human cancers.</a> RNA Biol. 15 (1), 35-43 (2018).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355 (6320), aah7111(2017).</li>
<li>Tsung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi+screen+of+long+non-coding+RNAs+identifies+LINC03045+regulating+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">CRISPRi screen of long non-coding RNAs identifies LINC03045 regulating glioblastoma invasion.</a> PLoS Genet. 20 (6), e1011314(2024).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+tool+for+the+job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the right tool for the job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Yeo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+CRISPR+repressor+for+targeted+mammalian+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation.</a> Nat Meth. 15 (8), 611-616 (2018).</li>
<li>Parrish, P. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+synthetic+lethal+and+tumor+suppressor+paralog+pairs+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Discovery of synthetic lethal and tumor suppressor paralog pairs in the human genome.</a> Cell Rep. 36 (9), 109597(2021).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthologous+CRISPR-Cas9+enzymes+for+combinatorial+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Orthologous CRISPR-Cas9 enzymes for combinatorial genetic screens.</a> Nat Biotechnol. 36 (2), 179-189 (2018).</li>
<li>Petroulia, S., et al. CRISPR-inhibition screen for lncRNAs linked to melanoma growth and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetroulia%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>New England Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NEBuilder+HiFi+DNA+Assembly+Reaction+%28E2621%29+v2%22">NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction (E2621) v2</a>. , (2020).</li>
<li>Cortés-Ríos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+by+bicinchoninic+acid+%28BCA%29+assay+follows+complex+kinetics+and+can+be+performed+at+short+incubation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times.</a> Anal Biochem. 608, 113904(2020).</li>
<li>Junior, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunior%2C+N+%22Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28SDS-PAGE%29+v1%22">Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) v1</a>. , (2019).</li>
<li>Chen, X., Liu, J., Janssen, J. M., Gonçalves, M. A. F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+structure+differentially+impacts+high-specificity+CRISPR-Cas9+Nuclease+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">The chromatin structure differentially impacts high-specificity CRISPR-Cas9 Nuclease strategies.</a> Mol Ther Nucl Acids. 8, 558-563 (2017).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).</li>
<li>Daer, R. M., Cutts, J. P., Brafman, D. A., Haynes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+chromatin+dynamics+on+Cas9-Mediated+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Syn+Biol%22%5BJournal%5D)">The impact of chromatin dynamics on Cas9-Mediated genome editing in human cells.</a> ACS Syn Biol. 6 (3), 428-438 (2017).</li>
<li>Chavez, M., Rane, D. A., Chen, X., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+of+large+transgenes+via+the+knock-in+of+an+integrase-deficient+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Stable expression of large transgenes via the knock-in of an integrase-deficient lentivirus.</a> Nat Biomed Eng. 7 (5), 661-671 (2023).</li>
<li>Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+and+variegation+of+gammaretrovirus+and+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors.</a> Human Gene Ther. 16 (11), 1241-1246 (2005).</li>
<li>Shrestha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenetics+guided+identification+of+tissue-specific+genomic+safe+harbors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenetics guided identification of tissue-specific genomic safe harbors.</a> Genome Biol. 23 (1), 199(2022).</li>
<li>Chu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfection+and+induction+of+apoptosis+in+melanoma+cells+by+branched+poly%28%CE%B2-amino+ester%29s+with+uniformly+distributed+branching+units%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfection and induction of apoptosis in melanoma cells by branched poly(β-amino ester)s with uniformly distributed branching units.</a> J Control Release. 367, 197-208 (2024).</li>
<li>Han, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+is+a+highly+effective+gene+transfer+techfnique+for+human+melanoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Nucleofection is a highly effective gene transfer techfnique for human melanoma cell lines.</a> Exp Dermatol. 17 (5), 405-411 (2008).</li>
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인간 게놈의 3% 미만이 단백질을 암호화하지만 게놈의 약 80%가 전사됩니다 1,2. 비암호화 전사 단위 중 수만 개는 200개의 뉴클레오티드를 초과하는 긴 비암호화 RNA(lncRNA)로 분류되며, 인간 lncRNA의 총 수는 100,000개를 초과하는 것으로 추정됩니다 3,4. 코딩 유전자와 대조적으로, lncRNA는 종 간에 덜 보존됩니다. 인간이 침팬지와 같은 영장류와 게놈의 99%를 공유한다는 점을 감안할 때, lncRNA는 표현형 진화에 훨씬 더 큰 영향을 미치기 위해 가설을 세웠습니다 5,6. 이러한 발견은 lncRNA의 중요한 세포 기능을 나타냅니다. lncRNAs의 규칙 및 RNA 결합 단백질 및 다른 RNAs와의 그들의 상호 작용은 불완전하게 이해된 채로 남아 있고, 많은 lncRNAs는 아직 완전히 주석이 달리지 않더라도, lncRNAs가 암 7,8,9,10와 같은 건강 그리고 질병에 있는 세포와 조직 특정한 표정 본을 전시한ᄂ다는 것은 분명합니다. 이들은 유전자 전사 조절(gene transcription regulation), 염색질 상호작용(chromatin interaction)11, RNA 처리(RNA processing)12, RNA 안정화(RNA stabilization)13, 번역 조절(regulation of translation)14 등 다양한 기능에 관여하고 있습니다.
암에서 매우 다양한 세포 유형 특이적 lncRNA는 유전자 발현을 조절하여 종양 발달 및 전이에 영향을 미치며, 가치 있는 치료 표적으로서의 잠재력을 강조합니다15. 종양 샘플에서 바이오마커로 lncRNA를 검출하는 것 외에도16, 종양 특이적 lncRNA를 표적으로 하여 다운스트림 기능을 방해하는 것은 임상 응용 분야와 기초 연구 모두에서 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. lncRNA의 역할을 규명하기 위한 RNA 기반 접근 방식에는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 짧은 헤어핀 RNA 및 작은 간섭 RNA(siRNA)가 포함됩니다17,18. siRNA는 일반적으로 유전자 침묵 스크리닝에 사용되지만, siRNA 기반 knockdown은 세포질19로 제한됩니다. 그러나 lncRNA는 핵 내에서 자주 작동합니다.
대안적으로, CRISPRi(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats interference)를 사용하여 인간 암에서 lncRNA를 억제할 수 있습니다20. 또한, 게놈 와이드 CRISPRi 스크리닝은 쉽게 프로그래밍할 수 있으며 광범위한 코딩 및 비코딩 유전자를 표적으로 하여 기능적 영향을 조사할 수 있습니다21,22. CRISPRi에서 촉매 결핍 Cas9 (dCas9)는 KRAB(Krüppel-associated box) 도메인과 같은 전사 억제 도메인(transcriptional repressor domain)에 융합됩니다23. dCas9-KRAB에 의한 유전자 억제는 가이드 RNA(gRNA)에 의해 관심 영역으로 유도됩니다. CRISPRi는 DNA 수준에서 유전자를 제어하여 전사 후 수준24에서 활성화되는 RNA 간섭과 대조적으로 더 높은 효율성과 원하는 기능 상실 표현형을 유도합니다. 표적 침묵에 대한 KRAB의 제한된 효능에 대응하여, 보다 효과적인 억제 전략으로 KRAB 및 MeCP2와 dCas9의 융합이 도입되었습니다25.
단일 유전자 침묵이 암 생존력에 영향을 미칠 수 있지만, 합성 이중 또는 다중 치사적 상호 작용은 세포 사멸로부터 암세포를 구할 수 있습니다26. 합성 치사율은 두 개 이상의 유전자를 포함하며, 각 유전자는 다른 유전자의 기능을 보상할 수 있습니다. 단일 유전자 녹다운(knockdown) 스크리닝의 문제점을 극복하기 위해, 치사량 단백질 코딩 유전자 쌍을 표적으로 하는 이중 CRISPR 전략은 유망한 접근법을 제공합니다27.
여기에서는 인간 흑색종 세포에서 KRAB-MeCP2에 융합된 황색포도상구균 및 연쇄상구균 화농성 dCas9를 사용하여 lncRNA 또는 기타 비암호화 RNA 쌍의 직교 CRISPRi 기반 표적화의 조합 사용을 위한 프로토콜을 제시합니다( 그림 1 참조). 이 프로토콜은 고전적인 CRISPR 조합 녹다운(knockdown) 또는 암에서 합성 치사쌍의 CRISPRi 기반 스크리닝으로 활용될 수 있습니다. CRISPRi 접근법에서 두 가지 다른 dCas9 종인 SpCas9 및 SaCas9를 사용하면 최소한의 교차 반응으로 고유한 게놈 유전자 자리를 독립적으로 표적화할 수 있으므로 높은 표적 선택성을 보장하면서 특이성과 유연성을 향상시킬 수 있습니다. 다양한 프로토 스페이서 인접 모티프 (PAM)가 사용됩니다 : SpCas9의 경우 NGG, SaCas9의 경우 NNGRRT가 사용됩니다. 이중 dCas9 시스템은 단일 유형의 dCas9을 사용할 때 정밀한 동시 조절을 가능하게 하고 sgRNA-RNP 복잡한 경쟁을 줄여 제한된 sgRNA 호환성과 같은 문제를 해결합니다. 이 혁신은 이중 sgRNA 라이브러리 스크리닝의 견고성과 다양성을 향상시킵니다. 결론적으로, 우리는 암 모델로서 흑색종 세포에서 완전한 기능을 갖춘 이중 CRISPRi 시스템을 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig01.jpg"> 
그림 1: 비암호화 RNA의 합성 치사 상호작용을 표적으로 하는 이중 CRISPRi 시스템의 계획. (A) 이중 gRNA 벡터의 클로닝 절차. (B) HEK293 세포에 envelope plasmid VSV-G, 패키징 plasmid PAX2 및 transfer vector를 transfection하여 501-mel 세포로의 후속 transduction을 위한 렌티바이러스를 생성했습니다. SpdCas9-KRAB-MeCP2(파란색) 및 SadCas9-KRAB-MeCP2(빨간색)에 대한 유전 정보를 포함하는 렌티바이러스를 501-mel 세포에 동시에 통합했습니다. 항생제 선별 후, 원하는 이중 gRNA(올리브 그린)를 통합하기 위해 두 번째 렌티바이러스 형질도입을 수행했습니다. (C) dCas9 변이체를 발현하는 501-mel 세포는 해당 gRNA와 상호 작용하여 표적 유전자 발현을 침묵시켜 암세포 사멸을 초래합니다. BioRender.com 로 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Amicon 초원심 필터, 100 kDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. aureus) (6H4) 마우스 단클론 항체</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>48989</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3) 단클론 항체</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>항-GAPDH 마우스 단클론 항체&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 IgG (전체 분자)&ndash; 토끼</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9044</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP 이미징 시스템에서</td> 생성된 과산화효소 항체&nbsp;<td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine S hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 발광 세포 생존율 분석</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL 기질, 500 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터 모델: CB 170</td><td>바인더</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I(BsmB1) 제한 효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 mL 혈청학적 피펫</td><td>코닝</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25 mL 혈청학적 피펫</td><td>코닝</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 혈청학적 피펫</td><td>코닝</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 시</td><td>그마 Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM), 고포도당, 피루브산</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>인간 흑색종 세포주 501-mel</td><td>은 Aifantis Lab (New York University)에서 친절하게 제공되었습니다.</td> <td>RRID: CVCL_4633</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon -P PVDF Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293T HEK 세포주</td><td>Takara Bio</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell system&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 핸드캐스트 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 조립 반응&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>무지방 분유&nbsp;</td><td>Biomol</td><td>54650</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 시료 완충액 (4개)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 매체</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브 0.5 ml (Flat Cap)</td><td>VWR International</td><td>732-3207</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Corning</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR 마스터 믹스 HF 버퍼</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531L</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레네</td><td>시그마 Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민, 분지</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-108071A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, 5 M 아쿠아 솔루션, RNase Free</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60434.AE</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 PES 33mm 0.2 &mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 100, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 6 Well, Standard, F</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,20,005</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

암세포에서 비암호화 rna 간의 합성 치사 상호작용을 표적으로 하기 위한 이중 crispr-간섭 전략

Dual CRISPR-Interference Strategy for Targeting Synthetic Lethal Interactions Between Non-Coding RNAs in Cancer Cells

SadCas9-KRAB-MeCP2 및 SpdCas9-KRAB-MeCP2의 발현 카세트를 동일한 양의 렌티바이러스와 함께 형질도입을 사용하여 501-mel 세포에 동시에 통합했습니다. 이 CRISPRi 프로토콜은 dCas9-KRAB-MeCP2 변이체의 발현에 의존하기 때문에 웨스턴 블롯 분석은 단백질 수준에서 이의 존재를 확인하는 데 이상적입니다. 양성으로 transfection된 세포를 농축한 후, dCas9-KRAB-MeCP2 ortholog의 존재를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 위해 샘플을 수집했습니다. 성공적인 형질도입 시 SpdCas9-KRAB-MeCP2 융합 단백질(202 kDa) 및 SadCas9-KRAB-MeCP2 융합 단백질(170 kDa)에 해당하는 단일 밴드가 예상되며, 그림 2A와 같이 각 Cas9 ortholog에 특이적인 항체를 사용하여 확인되었습니다. 그러나 웨스턴 블롯이 실현 불가능한 경우 qPCR을 사용하여 mRNA 수준에서 융합 단백질을 확인할 수 있습니다.
기능적 억제인자를 안정적으로 발현하는 501-mel 세포가 생성되면 이중 gRNA 벡터를 사용하여 두 번째 렌티바이러스 형질도입을 수행했습니다. RP11 및 XLOC는 이전에 전이성 흑색종의 단기 배양에서 상향 조절되는 것으로 나타났으며, 개별 CRISPRi 표적화는 증식 및 세포 생존에 미치는 영향을 입증했습니다28. 따라서, 우리는 변형된 세포에서 누적되고 쉽게 관찰할 수 있는 성장 표현형을 예상하여 개념 증명 합성 치사 비암호화 RNA 조합으로 평가를 위해 이 lncRNA 쌍을 선택했습니다.
생존율 분석을 사용하여 암세포에서 이중 CRISPRi의 효과를 조사하려면 두 targeted lncRNA를 모두 효과적으로 억제해야 합니다. qPCR은 전사체 수준을 측정하여 이러한 억제를 확인하는 데 가장 적합한 방법입니다. 우리는 RNA 수준을 결정하고 잠재적으로 치명적일 수 있는 RP11 및 XLOC 쌍을 표적으로 할 때 세포 생존력을 조사하여 개발된 이중 CRISPRi 프로토콜의 기능을 평가했습니다. 따라서 타겟 RNA 수치를 낮추기 위해 RP11 및 XLOC를 타겟하는 다른 gRNA가 도입되었습니다. RNA의 억제는 SadCas9-KRAB-MeCP2 또는 SpdCas9-KRAB-MeCP2에 대한 타겟 특이적 gRNA를 사용하여 조사되었으며, Rosa26을 타겟하는 control gRNA와 함께 개별적으로 또는 조합하여 테스트되었습니다( 그림 2B 참조). XLOC 또는 RP11을 개별적으로 타겟하는 gRNA는 각각의 타겟을 효과적으로 억제했지만, XLOC-sa/RP11-sp 쌍을 사용해야만 XLOC과 RP11을 동시에 knockdown할 수 있었습니다.
선택된 XLOC-sa/RP11-sp gRNA 쌍을 사용하여 501-mel 세포주에서 XLOC 및 RP11 RNA 수준이 모두 성공적으로 감소함에 따라 이중 lncRNA 억제 생존력 분석이 수행되었습니다( 그림 2C 참조). 5일 후, 타겟 gRNA를 개별적으로 사용했을 때 세포 생존율은 Rosa26 control의 81%와 89%였습니다. RP11-sp와 XLOC-sa를 병용하면 RP11-sp 단독에 비해 훨씬 더 감소했으며, 세포 생존율은 Rosa26 대조군의 59%에 달했습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig02.jpg"> 
그림 2: 이중 lncRNA 억제 시스템의 기능. (A) 항-Cas9 항체를 사용하여 변형된 501-mel 세포에서 dCas9-KRAB-MeCP2 변이체를 검출하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. 형질도입이 없는 501-mel 야생형(WT) 세포를 대조군으로 사용하였다(원시 블롯에 대해서는 보충 그림 3, 보충 그림 4, 보충 그림 5, 보충 그림 6 참조). (B) 이중 gRNA를 변형된 501-mel 세포로 형질도입한 후 Rosa26 대조 세포와 관련된 RP11 및 XLOC RNA 수치의 qPCR 기반 분석. GAPDH는 하우스키핑 유전자로 사용되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표현됩니다.(C) 이중 lncRNA 억제 생존율 분석은 이중 gRNA를 3개의 독립적인 transduction에서 변형된 501-mel 세포에 통합한 후 수행되었습니다. 발광 값은 Rosa26 컨트롤로 정규화되었습니다. 생존도 결과는 SEM± 평균(n = 3)으로 표현됩니다. 쌍을 이루지 않은 t-검정을 수행했습니다. 별표(*)는 p &lt; 0.05에서 유의한 차이를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 플라스미드 맵. 이 맵은 Benchling(https://benchling.com/)으로 제작되었습니다. 프로토콜에서 사용된 플라스미드는 Addgene #96921 및 #110824에서 변형되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%201.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 보충 그림 2: 의 웨스턴 블롯 분석 dCas9-KRAB 표현식. (A) transfection 6일 후 501-mel 세포에서 SadCas9-KRAB 발현. (B) 501-mel 세포에서 SadCas9-KRAB 및 SpdCas9-KRAB의 순차적 형질도입은 형질주입 3주 후 SadCas9-KRAB 발현을 감소시켰습니다. (C) 501-mel 세포에서 SadCas9-KRAB과 SpdCas9-KRAB을 동시에 transduction한 결과, transfection 3주 후 SadCas9-KRAB 발현이 감소했다. (D) SadCas9-KRAB 및 SpdCas9-KRAB의 동시 형질도입 후 SpdCas9-KRAB 발현이 관찰될 수 있습니다. LV. μL에 사용되는 렌티바이러스의 부피. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%202.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: 웨스턴 블롯 SaCas9-KRAB 원시 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%203_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: 웨스턴 블롯 SpCas9-KRAB 원시 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%204_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 5: GAPDH_SpCas9-KRAB 원시 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%205_GAPDH_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 6: GAPDH_SaCas9-KRAB 원시 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%206_GAPDH_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 활용된 가이드 RNA 염기서열. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: 활용된 DNA 염기서열. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: dual-grna-zeo-gfp의 FASTA 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%201_dual-grna-zeo-gfp.fasta" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: dSpCas9-krab-mecp2의 FASTA 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%202_dSpCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: dSaCas9-krab-mecp2의 FASTA 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%203_dSaCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

암세포에서 비암호화 RNA 간의 합성 치사 상호작용을 표적으로 하기 위한 이중 CRISPR-간섭 전략

Long non-coding RNAs (lncRNAs) represent a vast and functionally diverse class of RNA molecules, with over 100,000 predicted in the human genome. Although ...

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유전학

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

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체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

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증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

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모형 유기체에 있는 큰 유전 스크린은 부정적인 유전 상호 작용의 확인으로 이끌어 냈습니다. 여기에서는 모델 유기체의 유전 화면에서 데이터를 사용하여 암에 있는 합성 치명적인 상호 작용을 표적으로 하는 약물 조합을 설명하는 데이터 통합 워크플로우를 설명합니다.

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

CRISPR과 같은 기술의 주요 장벽은 중요한 유전자를 파괴할 수 있는 off-target 이벤트입니다. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing'(CIRCLE-seq)은 의도하지 않은 절단 부위를 식별하기 위해 고안된 기술입니다. 이 방법은 CRISPR-Cas9의 게놈 전체 활성을 높은 감도로 편향 없이 매핑합니다.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

게놈 차원의 CRISPR/Cas9 스크리닝 방법을 적용하여 방사선의 저항성 및 민감성 유전자를 선택하기 위한 세심하고 구조화된 접근 방식이 제공됩니다. 이 프로토콜은 또한 임상적으로 투여되는 화학 약물에 대한 내성 메커니즘을 조사하는 다른 연구 노력을 위한 다재다능한 프레임워크 역할을 할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

방사선 민감성 및 방사선 저항성 유전자 공개를 위한 게놈 와이드 CRISPR 스크리닝

학습하세요 이중 CRISPRi 시스템을 활용한 흑색종 세포에서 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 조합적 유전자 녹다운 방법을. 이 기술은 암 특이적 lncRNA 상호작용을 식별하여 치료 전략 개발에 활용됩니다.

암세포에서 비암호화 RNA 간의 합성 치사 상호작용을 표적으로 하기 위한 이중 CRISPR-간섭 전략

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