암세포에서 비암호화 RNA 간의 합성 치사 상호작용을 표적으로 하기 위한 이중 CRISPR-간섭 전략
2025년 5월 30일
이 연구는 흑색종 세포에서 긴 non-coding RNA를 표적으로 하는 이중 CRISPRi 시스템을 제시합니다. 이를 통해 조합 유전자 녹다운(combinatorial gene knockdown) 및 합성 치사 스크리닝(synthetic lethal screening)을 가능하게 하여 잠재적인 치료 전략을 위한 암 특이적 lncRNA 상호 작용을 식별할 수 있습니다.
우리의 목표는 암에서 비코딩 RNA에 중점을 두고 중요한 네트워크 허브를 체계적으로 식별하고 치료적으로 표적으로 삼는 것입니다. 우리 접근법의 현재 실험적 과제는 많은 수의 유전자를 병렬로 생성하고 스크리닝하는 데 필요한 조합 능력에 있습니다. 우리는 내성 및 치료 탈출을 우회하기 위해 새로운 조합 비암호화 RNA 표적 또는 약물 투여 가능한 구조를 식별할 수 있는 길을 닦는 것을 목표로 합니다.
앞으로 당사는 이 개념 증명 도구를 대규모 조합 라이브러리 스크리닝 노력으로 전환할 것이며, 잠재적으로 in vitro 및 in vivo 모두에서 RNA 결합 단백질과 결합할 수 있습니다. 먼저 혈구계에서 Trypan blue 염료를 사용하여 Lenti-X 293T HEK 세포를 계수합니다. 플레이트를 10cm 플레이트당 6개의 Lenti-X 293T HEK 셀 6개로 4배 10회 배하고 배양하여 다음날 약 80%의 포화도를 달성합니다.
이 단계부터는 클래스 2 실험실에서 작업합니다. 500 μl의 적절한 transfection medium을 transfer vector, envelop plasmid 및 pPAX2 vector와 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
별도의 튜브에서 500마이크로리터의 환원된 혈청 배지와 36마이크로리터의 PEI 시약을 밀리리터당 1밀리그램 농도로 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 두 혼합물을 결합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
이제 조심스럽게 적방울로 혼합물을 6 밀리리터를 함유 한 세포 배지에 넣고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 밤새 배양합니다. 12-15시간 후, 혈청학적 피펫을 사용하여 배지를 오토클레이브 가능한 폐기물 병에 폐기합니다. 혈청학적 피펫 및 피펫 팁을 포함한 소모품을 오토클레이브 폐기물에 버리기 전에 소독 용액으로 헹굽니다.
새 피펫을 사용하여 transfection된 세포에 5ml의 새로운 DMEM을 추가합니다. 렌티바이러스를 채취하려면 transfection 후 48시간 후에 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 50ml 표준 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 5ml의 신선한 배지를 세포에 추가하고 추가로 24시간 동안 배양합니다.
튜브를 냉장고에 보관하십시오. 배양 후, 렌티바이러스 수집을 반복하고 이전에 수집된 샘플과 함께 풀링합니다. 세 번째 수확 후 저장고는 여과 및 원심분리까지 섭씨 4도에서 세 가지 수확 모두의 상층액을 결합했습니다.
위험 그룹 2 유기체에 대해 승인된 에어로졸 밀폐 용기와 로터에서 500G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 복합 상등액을 원심분리한 다음 0.2마이크로미터 멸균 세포 배양 등급 주사기 필터를 통해 상등액을 여과합니다. 여과된 상등액을 1000G와 섭씨 4도에서 약 500마이크로리터로 분자량이 100킬로달톤 절단된 원심 필터 장치를 사용하여 농축합니다. 50-100 마이크로 리터의 바이러스 분취액은 섭씨 영하 80도에서 계속 사용할 때까지 보관하십시오.
6웰 플레이트에 501-mel 세포를 2배, 10배로 웰당 5개의 세포의 거듭제곱으로 플레이트화하고 형질도입 하루 전에 최종 배양 부피는 2ml입니다. 배양 배지를 최종 농도 1밀리리터당 6마이크로그램의 폴리브레렌이 보충된 2밀리리터의 예열된 DMEM으로 교체합니다. 이 단계부터 클래스 2 실험실에서 작업하십시오.
준비된 SPD 및 SAD 렌티바이러스 50마이크로리터를 동시에 세포에 적가합니다. 접시를 부드럽게 흔들고 37% 이산화탄소 대기에서 섭씨 5도에서 배양합니다. transduction 후 16시간이 지나면 혈청학적 피펫을 사용하여 배지를 오토클레이브 가능한 병에 폐기합니다.
Blasticidin 밀리리터당 10마이크로그램과 퓨로마이신 밀리리터당 2마이크로그램을 함유한 신선한 배지 2ml를 추가합니다. 2일 후에 배지 치환 단계를 반복하고 형질도입 후 7일 후에 S1 조건에서 형질도입된 세포를 처리합니다. 100마이크로리터의 예열된 DMEM이 있는 96웰 플레이트에 형질도입 후 7일 후에 안정적인 형질주입된 SadCas9 KRAB 및 Sp-dCas9-KRAB을 포함하는 5개 세포의 거듭제곱으로 0.1배의 0배를 시드합니다.
형질도입 당일, 배지를 밀리리터당 6마이크로그램의 폴리브레렌이 보충된 100마이크로리터의 예열된 DMEM으로 교체합니다. 세포에 적절한 양의 렌티바이러스를 추가하고 플레이트를 배양합니다. 16시간 후 배지를 Zeoin, Blasticidin 및 puromycin이 포함된 새 배지로 교체합니다.
형질도입 5일 후 제조업체의 지침에 따라 세포 생존율 분석을 사용하여 발광 검출을 수행합니다. 서양의 혈액 분석은 트랜스듀서 501-mel 세포에서 SpdCas9 및 SadCas9 융합 단백질의 성공적인 발현을 확인했습니다. 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석은 특정 가이드 RNA를 사용하여 개별 긴 비암호화 RNA RP11 및 XLOC의 효과적인 녹다운을 보여주었지만 XLOC-sa 및 RP11-sp 쌍만이 두 표적을 동시에 성공적으로 억제했습니다.
XLOC-sa 및 RP11-sp GRNA 쌍을 사용한 RP11 및 XLOC의 이중 억제는 대조군에 비해 501-mel 세포 생존율을 59%로 유의하게 감소시켰습니다.
개요
본 연구는 흑색종 세포에서 장열성 비암호화 RNA를 타겟팅하는 이중 CRISPRi 시스템을 제시합니다. 이는 조합적 유전자 결손과 합성 치명성 스크리닝을 가능하게 하며, 잠재적인 치료 전략을 위한 암 특이적 lncRNA 상호작용을 식별합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 종양학
- 유전학
배경
- 장열성 비암호화 RNA(lncRNA)는 암 생물학에서 중요한 역할을 합니다.
- lncRNA를 타겟팅하는 것은 흑색종에 대한 새로운 치료 전략을 제공할 수 있습니다.
- 현재 방법은 조합적 유전자 타겟팅에서 어려움을 겪고 있습니다.
- CRISPRi 기술은 유전자 결손을 위한 유망한 접근법을 제공합니다.
연구 목적
- 흑색종에서 중요한 lncRNA 네트워크 허브를 식별하고 치료적으로 타겟팅합니다.
- 조합적 유전자 결손을 위한 이중 CRISPRi 시스템을 개발합니다.
- 암 치료 내 저항을 극복할 수 있는 잠재적 치료 전략을 탐구합니다.
사용된 방법
- Lenti-X 293T HEK 세포에 CRISPRi 구성 요소를 도입합니다.
- 렌티바이러스를 수확하고 농축하여 전달합니다.
- 이중 가이드 RNA를 사용하여 흑색종 세포를 전달합니다.
- 세포 생존율과 유전자 결손 효율성을 평가합니다.
주요 결과
- 흑색종 세포에서 SpdCas9와 SadCas9 융합 단백질의 성공적인 발현.
- 특정 가이드 RNA를 사용하여 RP11과 XLOC lncRNA의 효과적인 결손.
- RP11과 XLOC의 조합적 억제가 세포 생존율을 현저히 감소시킵니다.
- 치료적 타겟팅을 위한 잠재적 lncRNA 상호작용을 식별합니다.
결론
- 이중 CRISPRi 시스템은 흑색종에서 lncRNA를 타겟팅하는 데 효과적입니다.
- 조합적 접근법은 암에 대한 치료 전략을 향상시킬 수 있습니다.
- 이러한 발견의 임상적 의미를 탐구하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Combinatorial targeting of long non-coding RNAs (lncRNAs) using dual CRISPR interference (CRISPRi) enables systematic interrogation of synthetic lethal interactions in cancer cells. This approach addresses the challenge of identifying critical non-coding RNA network hubs that drive cancer cell survival and therapeutic resistance. The dual CRISPRi system enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions in oncology discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of lncRNA pairs to clarify their roles in cancer cell viability.
- Supports biological de-risking by identifying synthetic lethal interactions among non-coding RNAs.
- Facilitates prioritization of lncRNA targets for further mechanistic and therapeutic exploration.
Screening & Assay Development
- Prepares validated melanoma cell systems for combinatorial gene knockdown screens.
- Delivers reproducible and quantitative viability readouts for robust assay development.
- Enables scalable screening of lncRNA interactions using orthogonal CRISPRi technologies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by targeting cancer-specific lncRNA interactions.
- Provides continuity from discovery-stage synthetic lethality screens to preclinical validation of candidate targets.
- Supports translational biomarker identification by linking lncRNA function to cell survival phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This dual CRISPRi strategy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-confidence target validation and combinatorial screening in cancer models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lncRNA function and network dependencies in cancer cells.
- Screening: Provides assay-ready systems for combinatorial synthetic lethal screens with quantitative viability outputs.
- Analytics: Generates statistical measurements of cell viability and gene knockdown efficiency for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical studies by identifying lncRNA interactions relevant to cancer progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for iterative combinatorial screening across diverse lncRNA targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in lncRNA target validation and synthetic lethality mapping.
- Operational Value: Standardizes combinatorial gene knockdown workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by de-risking target selection and prioritizing actionable lncRNA interactions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of novel non-coding RNA targets in oncology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPRi design, lentiviral production, and cell-based screening.
- Demands access to molecular biology infrastructure and quantitative viability assays.
- Necessitates cross-team standardization of guide RNA design and assay protocols.
- May require adaptation for different cancer cell models or lncRNA targets.
- Dependent on robust statistical analysis to interpret synthetic lethal interactions.
