Name: 초기 단계 제브라피시 유충의 소분자 스크리닝 및 독성 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 52 s
Description: 학습하세요 제브라피시 유충을 이용한 소분자 스크리닝 및 독성 테스트 방법을. 3-7일령 유충의 형태학적 변화를 관찰하여 약물 효과와 발달 독성을 평가하는 기술입니다.

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<ol><li>Teame, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Front%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models.</a> Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).</li>
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<li>Keenan, S. R., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+phases+of+zebrafish+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental phases of zebrafish myogenesis.</a> J Dev Biol. 7 (2), 12(2019).</li>
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<li>He, H., Wang, C., Tang, Q., Yang, F., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+mechanisms+of+prednisolone-induced+osteoporosis+in+zebrafish+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Possible mechanisms of prednisolone-induced osteoporosis in zebrafish larva.</a> Biomed Pharmacother. 101, 981-987 (2018).</li>
<li>Huang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bone+transgenic+zebrafish+in+anti-osteoporosis+chemical+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Model+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening.</a> Animal Model Exp Med. 1 (1), 53-61 (2018).</li>
<li>Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+of+primary+patient+derived+tumor+xenografts+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish.</a> J Vis Exp. (158), e60996(2020).</li>
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<li>Hayot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+toxicity+of+chemicals+using+a+zebrafish+vibration+startle+response+screening+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system.</a> J Vis Exp. (203), e66153(2024).</li>
<li>Hoyberghs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+concentrations+up+to+1%25+are+safe+to+be+used+in+the+zebrafish+embryo+developmental+toxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay.</a> Front Toxicol. 3, 804033(2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Starlab</td><td>E1415-1510</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L 마이크로 피펫 (P10)</td><td>Gilson</td><td>F144802&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10/20 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>Starlab</td><td>S1110-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L 마이크로 피펫 (P1000)</td><td>Gilson</td><td>F123602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7512</td><td>멸균, 단일 포장, 미처리, 뚜껑</td></tr><tr><td>포함 20 &micro; L 마이크로 피펫 (P20)</td><td>Gilson</td><td>F123600&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &마이크로; L 마이크로 피펫 (P200)</td><td>Gilson</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &마이크로; L 멀티채널 피펫&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F81024</td><td></td></tr><tr><td>200 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>Starlab</td><td>S1113-1006</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7596</td><td>멸균, 단일 포장, 평평한 바닥, 미처리, 뚜껑</td></tr><tr><td>포함 내부 그리드 경사진 바닥, 탱크 칸막이 및 뚜껑이 있는 사육 탱크</td><td>Tecniplast</td><td>ZB17BTISLOP, ZB17BTE,&nbsp; ZB17BTL, ZB17BTD</td><td>경사진 내부 탱크</td></tr><tr><td>메시 여과기</td><td>/</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td>메르카토르</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>페트리 접시&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>CC7672-3394 / CC7672-3359</td><td>100 x 20 mm 또는 60 x 15 mm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica M205 FCA 형광 실체 현미경</td><td>Leica</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>펠티에 냉각 인큐베이터 조명 모듈이있는 2 개의 선반 포함 차가운 흰색</td><td>Memmert</td><td>IPP110ecoplus, T8</td><td>주야간 사이클</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide 장착</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>504341000</td> E3 염화칼슘 디하이드레이트<td>에 1% 용액을 준비하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>Biochem Chemopharma</td><td>303080500</td><td>E3</td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td>를 준비하기 위해 <td>Biochem Chemopharma</td><td>313060500</td> E3 염화칼륨을 <td>준비하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>Biochem Chemopharma</td><td>316030500</td><td>E3</td></tr><tr><td>SCREEN-WELL을 준비하기 위해&nbsp; Wnt Pathway library (Bosutinib)</td><td>Enzo</td><td>BML-2838-0500</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3161/53</td><td>E3</td></tr></tbody></table>

초기 단계 제브라피시 유충의 소분자 스크리닝 및 독성 테스트

Small Molecule Screening and Toxicity Testing in Early-stage Zebrafish Larvae

이상은 7dpf까지 실험 타임라인에 걸쳐 개별적으로 또는 누적적으로 볼 수 있습니다. 이상별 최대 형태 점수는 사용된 유충 수의 백분율로 형태학적 이상을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 7일차에 scorer 1과 2의 심낭부종 형태 점수가 각각 19와 20이고, 가능한 점수 24점 중, 즉 24마리의 유충 중 19마리 또는 20마리의 유충이 심낭부종을 보이는 경우, 백분율 점수는 다음과 같이 계산할 수 있습니다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67759/67759eq1.jpg">
보충표 S1 은 만성 골수성 백혈병의 치료를 위해 지시된 티로신 키나아제 억제제인 화합물 보수티닙(Bosutinib)에 대한 독성 시험에 따른 4 dpf에서 (두 스코어러의 형태학 점수 결과를) 보여준다15. 5 dpf에서 7 dpf까지 노화된 노출된 물고기에 대해 동일한 형태 점수가 반복됩니다. 화합물은 100 μM에서 6.25 μM의 농도 범위를 사용하여 테스트되었습니다. 서로 다른 시점에서 세 번의 기술적 복제가 수행되었으며, 유충의 50%가 생존하는 농도인 LC50을 결정하기 위해 7 dpf에서 평균 누적 폐사율을 사용했습니다. LC(50 )는 임의의 노출 시점에서 측정될 수 있다. 그러나 7dpf에서 계산하는 것이 좋습니다.
7 dpf에서의 누적 평균 사망률은 그림 3에서 볼 수 있는 LC50 곡선을 생성하는 데 사용되었습니다. Bosutinib의 경우 LC50 농도는 37.95μM로 추정되었습니다.
참고: 이 추정된 LC50 농도는 이 모델 시스템에 엄격하게 적용되며 추가 다운스트림 표현형 분석 분석에 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig1.jpg"> 
그림 1: 3-7 dpf에서 유충에서 제안된 약물 스크리닝의 개략도. 96웰 테스트 플레이트는 화합물 Bosutinib에 대해 100μM에서 6.25μM 범위의 5가지 농도를 조사하기 위해 설정됩니다. 약어 : dpf = 수정 후 일수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig2.jpg"> 
그림 2: 다양한 화학 농도에 노출된 5dpf(노출 후 2일)에서 제브라피시 유충에서 관찰된 대표적인 형태학적 결함. (A) (영향받지 않은) 제브라피쉬, (B) 경미한 심낭부종을 보이는 제브라피시 유충, (C) 심한 심낭부종과 난황 출혈을 보이는 제브라피시, (D) 발달 지연, 색소 침착 감소, 작은 수영 방광이 있는 제브라피시, (E) 난황이 부풀어 오르고 꼬리 지느러미가 꼬인 제브라피시, (F) 꼬리 지느러미가 없는 제브라피시, (G) 구부러진 노토코드를 가진 제브라피시, (H) 꼬리가 잘린 제브라피시, (I) 괴사가 있는 죽은 제브라피쉬. 결함은 빨간색 화살촉으로 표시됩니다. 스케일 바 = 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig3.jpg"> 
그림 3: % 폐사율에 대한 농도를 보여주는 LC50 곡선. 테스트된 5가지 농도는 100μM, 50μM, 25μM, 12.5μM 및 6.25μM였으며 사망률은 각각 100%, 100%, 29.2%, 12.5% 및 12.5%였습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>형태학적 결함</td>
			<td>묘사</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>심낭 부종</td>
			<td>심장이 늘어나고 혈액 순환이 오작동하면서 심장 주위에 체액이 축적됩니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>심장 박동(분당)</td>
			<td>분당 비트 수 감소</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>노른자위</td>
			<td>심장 결손과 동시에 발생할 수 있는 난황 부종 또는 출혈의 유무</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>노른자 확장</td>
			<td>부풀어 오르거나 얇거나 없는 노른자</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>곡선 노토코드</td>
			<td>꼬이거나 물결 모양의 노토코드 및/또는 구부러진 꼬리의 존재</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>부레를 헤엄치다</td>
			<td>부레의 존재, 부재 또는 부분적 발달</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>착 색</td>
			<td>같은 나이의 처리되지 않은 물고기에 비해 멜라닌 세포가 적거나 전혀 없습니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>괴 사</td>
			<td>신체의 어느 부위에도 괴사의 존재(경증 또는 중증) 또는 괴사의 부재</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>개발 지연</td>
			<td>같은 나이의 야생형 대조군에 비해 개발이 지연되거나 지연되었습니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>터치에 대한 반응</td>
			<td>놀람 후 응답이 지연되거나 반응이 없는 경우(예: 피펫 팁 사용)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>잘림</td>
			<td>후방 제브라피시 몸체의 부재(즉, 꼬리의 형성)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>지느러미</td>
			<td>얇은 난황 확장을 동반할 수 있는 꼬리 지느러미의 유무</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>감소된 본체 축</td>
			<td>정상으로 보이지만 측정했을 때 길이가 더 짧은 물고기입니다.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 약물 노출 연구 후 관찰할 수 있는 시각적 형태학적 결함 목록.
보충 표 S1: 4 dpf(노출 후 1일)에서 Bosutinib에 대한 대표적인 형태학적 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/SupplementalTable_1.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Zebrafish have become a prominent model organism for human translational research, toxicity testing of small molecules and environmental pollutants, ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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초기 단계 제브라피시 유충의 소분자 스크리닝 및 독성 테스트

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