만성 상처 관리를 위한 Core-sheath 3D-Bioprinted Scaffold를 사용한 세포외 소포 전달 최적화
February 28th, 2025
이 연구는 만성 상처 치유를 위한 코어피(core-sheath) 3D 바이오 프린팅 골격을 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세포외 소포체는 중간엽 줄기세포에서 분리되어 카르복시메틸 셀룰로오스와 알기네이트 리아제로 만든 칼집을 통해 코어(알긴산)에 적재됩니다. 이 설계는 제어된 비계 성능 저하와 효율적인 EV 방출을 가능하게 합니다.
연구 범위는 효과적인 만성 상처 관리를 위한 고급 생리활성 상처 드레싱 설계를 개발하는 것입니다. 스캐폴드는 세포외 소포의 제어, 분해 및 효율적인 국소 전달을 보장합니다.
현재 프로토콜은 만성 염증 관리에서 기존 상처 드레싱의 한계를 극복하는 것을 목표로 합니다. 특히, 제어, 분해 및 적시 세포외 소포 방출의 부족입니다.
이 프로토콜은 다양한 응용 분야에 대해 적시에 유전자를 포함한 치료제를 전달하기 위한 조정 가능한 접근 방식을 제공합니다.
모든 결과는 다양한 상처 유형에 맞는 스캐폴드를 맞춤화하고 세포외 소포에 특정 생리 활성 분자를 로드하여 재생 요법을 향상시키는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
우리 연구실은 당뇨병성 상처 치유를 다루기 위한 중개 연구 플랫폼을 구축할 것입니다.
[해설자] 시작하려면 섭씨 37도의 수조에서 중간엽 줄기 세포 바이알을 빠르게 해동합니다. 작은 얼음 조각이 남아 있으면 바이알을 꺼냅니다. 중간엽 줄기 세포 바이알의 전체 내용물을 완전한 배지가 들어 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포를 실온에서 5분 동안 200G에서 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 1밀리리터의 예열 완전 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 4밀리리터의 완전 배지가 들어 있는 T25 플라스크로 옮깁니다. T25 플라스크를 부드럽게 기울여 세포가 고르게 분포되도록 합니다. 플라스크를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 배양합니다. 세포가 70%에서 80% 합류에 도달하면 T25 플라스크에서 사용한 배지를 흡인합니다. 플라스크에 신선한 PBS 3밀리리터를 첨가하여 잔류 세포를 제거합니다. 그런 다음 플라스크에 0.25% 트립신 용액 1밀리리터를 넣고 배양합니다. 현미경으로 세포 박리를 4배 배율로 모니터링합니다. 이제 4밀리리터의 예열 완전 배지를 플라스크에 넣고 표면 위에서 위아래로 피펫을 사용하여 분리합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 15밀리리터 원심분리기 2개로 옮깁니다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 신선하고 완전한 배지에 재현탁하고 세포 수를 계산합니다. 그런 다음 세포를 제곱센티미터당 5,000개의 세포 파종 밀도를 가진 T75 플라스크로 옮깁니다. T75 플라스크를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 배양합니다. 72시간 후, 세포외 소포 분리를 위해 세포에서 조절된 배지를 수집합니다. 세포외 소포 또는 EV를 분리하려면 수집된 컨디셔닝 배지 13밀리리터를 800G에서 15분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 0.22마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 상청액을 여과하고 큰 입자를 제거합니다. 이제 여과된 컨디셔닝 배지에 5밀리리터의 침전 완충액을 추가합니다. 혼합물이 균질한지 확인하기 위해 혼합물을 철저히 소용돌이치십시오. 혼합물을 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 세포외 소포가 침전되도록 합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 20도에서 30분 동안 3,220G에서 원심분리합니다. 튜브의 균형을 확인합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 버리고 다시 5초 동안 원심분리합니다. 이제 소포 손상을 방지하기 위해 EV 펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 웨스턴 블로팅을 수행하여 CD63, CD81 및 CD9를 포함한 세포외 소포 특이적 마커를 검출합니다. 멸균 초순수에 신선한 4.5% 알긴산나트륨 용액을 준비합니다. 용액을 섭씨 60도에서 밤새 저어주어 완전히 용해되도록 합니다. 다음으로, 카르복시메틸셀룰로오스를 멸균 초순수에 용해시켜 3.8% 용액을 얻습니다. 준비된 바이오 잉크를 섭씨 25도에서 10분 동안 3,220G에서 원심분리하여 인쇄 과정을 방해할 수 있는 기포를 제거합니다. 이제 주사기 믹서를 사용하여 준비된 알긴산나트륨 용액 3밀리리터를 표지된 EV 또는 Dialymmi 대조군과 혼합합니다. 균일한 현탁액을 보장하기 위해 부드럽게 잘 섞습니다. 다른 주사기 믹서를 사용하여 멸균 초순수에 1밀리리터의 카르복시메틸셀룰로오스와 새로 준비된 알지네이트 리아제 용액을 결합하여 밀리리터당 0.5밀리미터 단위의 최종 농도를 달성합니다. 알지네이트나트륨 EV 바이오 잉크를 코어 부분에, 카르복시메틸셀룰로오스 알지네이트 리아제 바이오잉크를 주사기 설정의 칼집 부분에 동시에 로드합니다. 3D 바이오 프린터 소프트웨어를 실행합니다. 대각선 채우기 패턴이 있는 원통형 쉐이프를 선택하여 스캐폴드 구조를 작성합니다. 실린더 직경을 20mm로, 높이를 1.1mm로 설정합니다. 기공 크기를 1mm로 구성합니다. 코어 및 시스 노즐 펌핑 속도를 초당 1mm, 층당 두께 0.25mm로 설정합니다. 이동 속도를 초당 6mm로 구성하고 실온에서 4개의 레이어를 인쇄합니다. 에어로졸 염화칼슘이 함유된 가습기를 사용하여 압출 과정에서 비계를 가교합니다. 폴리에스테르 필름에 비계 인쇄를 시작합니다. 효과적인 가교를 보장하기 위해 가습기 노즐을 압출 헤드에서 약 20cm 떨어진 곳에 배치합니다. 스캐폴드를 2.2% 염화칼슘 용액에 10분 동안 담가 가교를 완료합니다. 비계를 멸균 초순수로 세 번 헹구어 과도한 염화칼슘과 결합되지 않은 바이오 잉크를 제거합니다. 마취된 OCTA 당뇨병 마우스의 등쪽 피부를 전기 이발기로 면도하여 피부 자극이나 부상을 피하십시오. 이제 각 마우스의 등쪽 표면에 6mm 원형 전체 두께의 피부 상처를 만듭니다. PKH 표지 세포외 소포가 포함된 3D 바이오프린팅 스캐폴드를 상처 침대에 부드럽게 놓습니다. 비계가 상처 표면을 완전히 덮고 있는지 확인하고 멸균 겸자로 가볍게 눌러 공기 주머니를 최소화합니다. 마취된 마우스를 이식 후 2시간, 4시간, 8시간 및 24시간에 IVIS 이미징 시스템으로 옮깁니다. 이미징 마법사에서 형광 이미징 옵션을 선택하고 PKH 염료에 대한 여기 및 방출 필터를 활성화합니다. 시야각, 피사체 높이 등 카메라 설정을 조정하여 신호 감지를 최적화하세요. 이미지 획득을 시작하고 결과 데이터를 저장합니다. 그런 다음 라벨이 붙은 EV에서 형광 신호를 방출합니다. 카르복시메틸셀룰로오스 알지네이트 리아제 스캐폴드의 알지네이트 EV는 특히 2시간 및 4시간 시점에서 카르복시메틸셀룰로오스에서만 알지네이트 EV에 비해 더 빠른 방출 프로파일을 나타냈습니다.
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개요
이 연구는 효과적인 만성 상처 관리를 목적으로 한 고급 생체 활성 상처 드레싱 설계를 개발하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 스캐폴드는 통제된 분해 및 세포외 소포의 효율적인 국소 전달을 보장하여 기존 상처 드레싱의 한계를 해결합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생체재료
- 상처 치유
배경
- 만성 상처는 중요한 임상 과제입니다.
- 기존 상처 드레싱은 종종 분해에 대한 통제가 부족합니다.
- 치료 제제의 효율적인 방출은 치유에 중요합니다.
- 세포외 소포(EVs)는 조직 복구 촉진에 잠재력이 있습니다.
연구 목적
- 코어-시스 3D 바이오 프린팅 스캐폴드를 제작합니다.
- 통제된 EV 방출을 통해 만성 상처 치유를 향상시킵니다.
- 기존 상처 드레싱 기술을 개선합니다.
사용된 방법
- 중간엽 줄기 세포로부터 세포외 소포의 분리.
- 알기네이트 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 사용한 코어-시스 스캐폴드 설계.
- 스캐폴드 제작을 위한 3D 바이오 프린팅 기술.
- 스캐폴드 분해 및 EV 방출 효율성 평가.
주요 결과
- 스캐폴드는 통제된 분해 특성을 보였습니다.
- 로드된 세포외 소포의 효율적인 방출이 이루어졌습니다.
- 만성 염증 관리의 개선이 관찰되었습니다.
- 이 프로토콜은 만성 상처 관리를 위한 유망한 접근 방식을 제공합니다.
결론
- 개발된 스캐폴드는 상처 치유를 크게 향상시킬 수 있습니다.
- EV의 통제된 방출은 더 나은 치료 결과로 이어질 수 있습니다.
- 이 접근 방식은 기존 상처 드레싱의 주요 한계를 해결합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Chronic wound management remains a significant translational challenge due to the need for controlled, localized delivery of regenerative agents. The core-sheath 3D-bioprinted scaffold enables tunable extracellular vesicle (EV) release, supporting predictive confidence in tissue repair strategies. This platform approach offers scalable, reproducible integration of bioactive delivery systems into early-stage regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-mediated regenerative pathways in disease-relevant wound models.
- Supports biological de-risking by isolating the impact of controlled EV release on tissue repair.
- Facilitates functional validation of EVs as therapeutic agents in chronic inflammation contexts.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible scaffold platform for quantitative assessment of EV release kinetics.
- Standardizes bio-ink formulation and 3D printing parameters for assay consistency.
- Enables reliable comparison of scaffold compositions and EV loading strategies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold degradation and EV release profiles with disease-relevant wound healing timelines.
- Supports continuity from in vitro optimization to in vivo preclinical wound models.
- De-risks advancement decisions by enabling quantitative imaging of EV biodistribution.
Pipeline & Workflow Integration
This scaffold fabrication and EV delivery protocol bridges early discovery, screening, and preclinical validation in regenerative medicine workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of EV-driven tissue regeneration in controlled wound environments.
- Screening: Delivers quantitative release profiles and reproducible scaffold architectures for downstream evaluation.
- Analytics: Provides fluorescence imaging outputs for comparative analysis of EV distribution and release kinetics.
- Translational Research: Supports alignment of scaffold performance with preclinical disease models, such as diabetic wounds.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for future therapeutic and biomaterial development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV-based regenerative strategies and target validation.
- Operational Value: Standardizes scaffold fabrication and EV incorporation for reproducible results.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing quantitative, scalable delivery data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of advanced wound care and regenerative medicine assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D bioprinting, bio-ink formulation, and EV isolation.
- Demands access to imaging systems for quantitative EV release and biodistribution analysis.
- Necessitates cross-team standardization of scaffold design and printing parameters.
- Adaptable to various wound models and EV sources with protocol optimization.
- Dependent on consistent EV characterization and scaffold reproducibility for translational success.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Mesenchymal Stem Cell (MSC) Culture and Isolation of Extracellular Vesicles (EVs) for Wound Management
4:56
3D Bioprinting of Alginate-Carboxymethyl Cellulose Alginate Lyase Scaffold Structure
7:37
Tracking Extracellular Vesicle (EV) Release in Wound Healing
8:56
Results
