Name: 나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 배우세요 PVA 및 PCL 나노섬유막을 이용한 상피세포와 섬유아세포의 3차원 공동배양 시스템 구축 방법. 이 기술은 조직 공학 연구에서 세포 상호작용과 다층 구조 형성을 효율적으로 분석하는 데 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>상피 세포와 섬유아세포 세포를 위한 첨단 2층 3D 공동 배양 시스템

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신/EDTA</td><td>웰진</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>100x 페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>20x PBS</td><td>LPS 용액</td><td>CBP007A</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Biosesang</td><td>PC2031-050-00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 접합 ZO-1 항체</td><td>Invitrogen</td><td>339194</td><td></td></tr><tr><td>항체 희석제 OP Quanto</td><td>Epredia</td><td>10129-576</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 분석 키트</td><td>Donginbio</td><td>CCK-3000</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 (150x20)</td><td>SPL</td><td>20151</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>삼춘</td><td>C0584</td><td></td></tr><tr><td>원추형 튜브</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Corning</td><td>CLS2980245</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도</td>당 <td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Welgene</td><td>LM 002-05</td><td></td></tr><tr><td>DURAN 데시케이터 베이스, 평면 플랜지, 나사 스레드</td><td>DWK Life Sciences&nbsp;</td><td>7.022 260</td><td></td></tr><tr><td>DURAN 유리 데시케이터 뚜껑 및 스톱콕</td><td>Daihan Science</td><td>SM.2444061</td><td></td></tr><tr><td>DURAN 스톱콕, PTFE 스핀들 포함</td><td>DWK Life Sciences&nbsp;</td><td></td><td></td>10322671</tr><tr><td>전기회전 기계</td><td>NanoNC</td><td>ESR200RD</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올, 순수</td><td>시그마 알드리치</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>시그마 알드리치</td><td>TMS-013-BKR&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>형광 레이저 컨포칼 스캐너 모듈 K1-fluo</td><td>나노스코프 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>젤/마운트</td><td>Biomeda&nbsp;Corp.</td><td>M01</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액</td><td>시그마 알드리치</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>금속 노즐 27G</td><td>NanoNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>네이처 리퍼블릭</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFlour 488</td><td>abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 Syringe_Lure 자물쇠 (10 mL)</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td>Poly(아크릴산)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>323667</td><td></td></tr><tr><td>Poly(비닐 알코올)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Polycaprolactone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>Pure HCL</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>SEC</td><td>SNE-4500M</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 유리</td><td>Marienfeld Superior</td><td>K15663717</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 set</td><td>omniscience</td><td>OMNI.05255</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 다중 모드 리더</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

나노섬유막(nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

이 프로토콜은 나노 섬유막 기반 2층 모델을 구축하여 MLE-12 폐 상피 세포와 NIH3T3 섬유아세포를 공동 배양하기 위한 중요한 단계를 간략하게 설명합니다(그림 1). 이 모델은 공동 배양된 세포의 라이브 셀 이미징, 면역조직화학 및 종말점 정량 분석에 적합합니다. 다른 세포 유형은 또한 세포 밀도 및 성장 조건을 최적화함으로써 활용될 수 있습니다.
SEM은 비드 형성 없이 제작된 PVA 나노섬유의 균일한 분포를 보여줍니다(그림 2A). PVA 나노 섬유의 직경은 150nm에서 230nm (180 ± 25 nm, 평균 ± 표준 편차 (SD)) 범위였습니다. 전기방사 PCL NM의 나노섬유는 무작위 배향을 가졌으며 구조적으로 콜라겐과 유사했습니다(그림 2B). PCL NM의 대부분의 섬유는 직경이 300nm에서 7μm(3.8± 2.5μm) 사이였습니다. 따라서 PVA 나노 섬유막은 PCL 나노 섬유막보다 기공 크기가 작았습니다.
파종 전에 MLE-12 및 NIH3T3 세포를 각각 Cell-Tracker 빨간색과 녹색으로 염색하고 공동 배양 과정 전반에 걸쳐 모니터링했습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 삽입 챔버의 MLE-12 세포와 하부 챔버의 NIH3T3 세포의 공간 분포를 뚜렷하게 관찰할 수 있었습니다. 포커스 스태킹 분석은 NIH3T3 세포가 다양한 깊이(102 ± 20μm)에서 분산 및 검출된 반면 MLE-12 세포는 80 ± 10μm 두께의 층을 형성한 것으로 나타났습니다. SEM은 세포막에 세포가 부착되어 있음을 보여줍니다. NIH3T3 세포는 PCL 나노섬유막에 침투하여 나노섬유 축을 따라 확장되는 반면, MLE-12 세포는 PVA 나노섬유막의 표면에 부착되어 응집을 나타냈습니다(그림 4). 다음으로, 액틴 염색을 통해 NIH3T3 세포와 MLE-12 세포의 세포골격 조직을 조사했습니다. PCL 나노섬유막에서 배양된 NIH3T3 세포는 조직 내 세포와 유사한 액틴 필라멘트의 발사체 분포를 보여주며, PVA 나노섬유막에서 배양된 MLE-12 세포의 액틴 염색은 세포 확산이 없는 둥근 응집체를 보여줍니다(그림 5).
단일배양(monoculture)과 공동배양(coculture)에서 MLE-12 세포의 분포 및 성장 패턴을 비교하였다. PVA NM에서 단일배양에서 Cell-Tracker 적색 염색 세포는 응집체를 형성했지만 공동 배양 상태의 세포는 멤브레인에서 균일한 분포를 유지했습니다(그림 6A). 컨포칼 현미경 이미지의 3D 분석에서 PVA NM에서 공동 배양된 MLE-12 세포의 성장 패턴은 섬유아세포가 없는 상태에서 배양된 세포에 비해 더 많은 융합 세포 밀도로 배양된 세포가 멤브레인에 층상 접착하는 것을 보여줍니다(그림 6B). 또한, 세포 응집체가 아닌 세포 표면(화살표로 표시)에서 세포 간 접착 및 구역 오클루딘(ZO)-1의 발현은 섬유아세포가 없는 배양에서보다 공동 배양 조건에서 더 분명했습니다(그림 6C).
멤브레인 상의 세포 증식은 CCK-8 분석을 사용하여 측정했습니다. NIH3T3 및 MLE-12 세포 증식은 시간이 지남에 따라 증가했습니다(그림 7). 그러나 배양 플레이트보다 멤브레인에서 세포의 성장 속도가 더 낮게 관찰되었습니다(데이터는 표시되지 않음). NM에서 공동 배양된 NIH3T3 및 MLE-12 세포는 배양 플레이트에서 단일배양된 세포에 비해 안정적인 성장률을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig01.jpg"> 
그림 1: 스캐폴드 기반 2층 시스템에서 NIH3T3 섬유아세포 및 MLE-12 상피 세포 공동 배양 방법을 설명하기 위한 개략도. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; PCL = 폴리(ε-카프로락톤). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig02.jpg"> 
그림 2: PVA 및 PCL 나노섬유의 구조. (A) PVA 및 (B) PCL 나노섬유막은 전기방사에 의해 생산되었습니다. 나노 섬유의 구조와 직경은 멤브레인 표면의 SEM으로 측정됩니다. 스케일 바 = 1μm(A), 10μm(B). 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; PCL = 폴리(ε-카프로락톤). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig03.jpg"> 
그림 3: 공동 배양 시스템에서 PCL 나노 섬유막의 NIH3T3 세포와 PVA 나노 섬유막의 MLE-12 세포의 공간 분포. NIH3T3 세포(4 × 105)는 Cell-Tracker Green으로 염색하고, MLE-12 세포(3 × 105)는 Cell-Tracker Red로 염색했습니다. 파종된 세포를 24시간 동안 배양하고 컨포칼 현미경의 Z-적층 이미지를 사용하여 관찰했습니다. 숫자는 μm로 표시됩니다. 화살표는 X(너비), Y(길이), Z(깊이)로 치수를 표시합니다. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; PCL = 폴리(ε-카프로락톤). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig04.jpg"> 
그림 4: PCL 나노섬유막의 NIH3T3 세포와 PVA 나노섬유막의 MLE-12 세포의 접착 및 형태. 세포를 24시간 동안 멤브레인에서 배양하고 2,000배 배율에서 SEM을 사용하여 관찰했습니다. 스케일 바 = 15μm. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; PCL = 폴리(ε-카프로락톤). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig05.jpg"> 
그림 5: PCL 나노섬유막의 NIH3T3 세포와 PVA 나노섬유막의 MLE-12 세포의 액틴 스트레스 섬유. NIH3T3 세포(4 × 10,5) 및 MLE-12 세포(3 × 10,5 세포)를 각각 PCL 및 PVA 나노섬유막에 파종했습니다. 48시간 배양 후, 세포를 phalloidin-iFlour 488로 염색하고 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰했습니다. 눈금 막대 = 50μm. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올; PCL = 폴리 (ε-카프로 락톤); FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig06.jpg"> 
그림 6: PVA 나노섬유막에서 공동배양된 MLE-12 세포의 성장 패턴. (A) Cell-Tracker 적색 염색 MLE-12 세포(3 × 105 개 세포)를 PVA 나노섬유막에 파종하고 단독(-NIH3T3 세포) 및 NIH3T3 세포와 함께 2층 시스템(+NIH3T3 세포)에서 48시간 동안 배양했습니다. (B) 48시간 동안 단일배양 및 공동 배양된 MLE-12 세포를 Hoechst 33342(파란색) 및 Phalloidin-iFlour 488로 염색하고 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰했습니다. 3D 이미지는 Imaris 소프트웨어의 표면 기능을 사용하여 표시됩니다. (C) MLE-12 세포를 48시간 동안 배양하고 Phalloidin-iFlour 488 및 anti-ZO-1 항체(빨간색)로 형광 표지했습니다. 눈금 막대 = 50μm. 약어: PVA = 폴리비닐 알코올. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig07.jpg"> 
그림 7: 2층 공동 배양 시스템에서 세포의 성장 속도. NIH3T3 세포(4 × 10,5) 및 MLE-12 세포(3 × 10,5)를 표시된 시간 동안 공동 배양합니다. 인서트 및 하단 웰의 세포 성장은 CCK-8 분석을 사용하여 측정합니다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

establishing-three-dimensional-coculture-module-epithelial-cells

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

간단한 방법은 관련 상피 세포에서 조직 섬유아 세포의 효과를 분석하는 설명되어 있습니다. 이 방법과 3 차원 조직 배양의 결합 차원에서 고립 후 세포의 분석을 용이하게하실 수 있습니다. 기술은 종양 세포에서 종양 - 관련 기질의 효과를 체계적으로 연구를 허용, 악성 잠재력을 변화의 세포에 적용됩니다.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

생체 재료 기술의 발전으로 3차원 다세포 유형의 구조를 개발할 수 있게 되었습니다. 우리는 기도의 주요 구조 세포를 배양하기 위해 3개의 개별 골격을 생산하여 기도 세기관지 벽의 3D 체외 모델을 제공하는 전기 방사 프로토콜을 개발했습니다.

전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해<em&gt; 체외</em&gt;기도 벽의 모델

이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

현재 bilayer 문화 모델 vivo에서 microenvironments 모방 기능 생체 외에서 연구에 대 한 허용 하지 않습니다. 폴 리 에틸렌 글리콜과 산화 아연 템플릿 메서드를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다 ultrathin biomimetic 지하실 막의 개발을 가변 강성, 다공성와 밀접 하 게 비보에 모방 하는 생 화 확 적인 구성 세포 외 매트릭스입니다.

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

이 프로토콜은 임상 및 생리병리학 적 모델에서 가능한 적용을위한 그들의 이질성 및 기능적 특성을 결정하기 위해 인간 양막의 상이한 해부학 적 영역에서 상피 세포의 분리를 설명합니다.

인간 양막의 다른 해부학 적 영역에서 상피 세포의 시험관 내 배양

제시된 프로토콜은 미세유체 동적 배양 채널과 기존의 고정 웰 정적 배양 챔버에서 부착 세포층 구조를 시각화하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색 기술의 개발 및 사용을 설명합니다. 이 접근법은 세포층 밀도, 단층 형성 및 층 두께 균일성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가

플라스틱 멤브레인이 있는 조직 배양 삽입물은 세포 배양 실험실에서 세포층과 장벽 조직 모델을 확립하기 위한 투과성 지지체로서 황금 표준입니다. 여기에서, 우리는 플라스틱 멤브레인을 재조합 기능화된 거미줄 단백질로부터 만들어진 생물학적으로 더 관련성이 높은 멤브레인으로 대체하는 간단한 방법을 제시한다.

맞춤형 조직 배양 인서트에 재조합 기능성 거미줄로 만든 Nanofibrillar 기저막 모방

폴리디메틸실록산(PDMS) 칩 장치의 막을 위한 방수 실리콘 기반 밀봉을 위한 새로운 밀봉 프로토콜. 실험실, 칩 모델 설정 및 소규모 칩 플랫폼 개발을 위한 것입니다. 우리는 플라스틱 및 천연 조직 막을 사용하여 프로토콜을 시연합니다. 이 절차는 PDMS, 톨루엔, 몰드, 멤브레인, 진공 챔버만 필요합니다.

유연하고 신뢰할 수 있는 접착을 위한 접근 가능한 실리콘 칩-멤브레인 밀봉 절차

광학 해상도 photoacoustic 현미경 (또는 - PAM)는 영상 광학 흡수 능력이 새로운 기술을...

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

배우세요 PVA 및 PCL 나노섬유막을 이용한 상피세포와 섬유아세포의 3차원 공동배양 시스템 구축 방법. 이 기술은 조직 공학 연구에서 세포 상호작용과 다층 구조 형성을 효율적으로 분석하는 데 활용됩니다.

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

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