Name: 원자력 현미경 도출된 힘 맵에서 토착 쥐 폐 기저막의 Youngs Modulus 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 배우세요 원자력 현미경을 이용해 쥐 폐 기저막의 Young's modulus를 측정하는 방법을. 동결절단과 MATLAB 데이터 분석으로 생체 샘플의 역학적 특성을 보존하며 암 세포 침윤과의 관계를 연구합니다.

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<table><tbody><tr><td>1mL 주사기</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Injekt-F</td></tr><tr><td>10mL 주사기</td><td>B Braun</td><td>4606108V</td><td>Injekt Luer Solo</td></tr><tr><td>15mL 팔콘 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>나사 캡 튜브</td></tr><tr><td>캔틸레버 - MLCT</td><td>Bruker AFM 프로브</td><td>3444</td><td>AFM 캔틸레버, 피라미드 팁 모양의</td></tr><tr><td>극저온 톱날</td><td>Leica Biosystems</td><td>14035843496</td><td>로우 프로파일 일회용 블레이드 DB80LX</td></tr><tr><td>극저온 탐 샘플 홀더</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740044</td><td>표본 디스크 30</td></tr><tr><td>Cyotome</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1950</td><td>Leica Cryostat</td></tr><tr><td>Direct Overlay Extension</td><td>Bruker</td><td></td><td>소프트웨어 확장 JPK SPM 소프트웨어 용 확장으로 도립 현미경의 광학 이미지를 SPM 소프트웨어의 데이터 뷰어로 가져올 수 있습니다.</td></tr><tr><td>일회용 기본 금형</td><td>Science Services</td><td>SA62534-15</td><td>Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>tesa Film</td><td>56661-00002</td><td>사진 필름 테이프</td></tr><tr><td>고정 스프링 캔틸레버 홀더</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경 - Leica DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK 전동 스테이지</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 4XP BioScience</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK SPM Software</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K5 CMOS microscope Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>버전 R2024a 이상</td></tr><tr><td>MATLAB - Curve Fitting Toolbox&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Image Processing Toolbox</td><td>매스웍스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Signal Processing Toolbox&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - 통계 및 머신 러닝 도구 상자</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Carl Roth</td><td>H869.1</td><td>캔틸레버 보정을 위한 일반 현미경</td></tr><tr><td>슬라이드 현미경 슬라이드 - 반투명 가장자리</td><td>Carl Roth</td><td>H870.1</td><td>냉동 절편을 위한 서리로 덥은 가장자리가 있는 현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>바늘 &슬래시; 0.9mm &시간; 25 mm</td><td>B Braun</td><td>4657500</td><td>OCT 주입&nbsp; 폐 샘플에</td></tr><tr><td>바늘 &슬래시; 0.9mm &시간; 70mm</td><td>B 브라운</td><td>4665791</td> AFM OCT 화합물 Sakura Finetek 4583 Tissue-Tek O.C.T. 화합물 인산염 완충 식염수 Bio&<td>에 PBS를 적용하는 긴 바늘</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>;<tr><td></td><td> </td><td>Ca2+, Mg2+, 500mL</td>QI 고급 이미징 확장 <td></td> 없이 BS.L1825 PBS 솔루션을 판매</tr>합니다.<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>B Braun</td><td>5518083</td><td>수술용 일회용 메</td></tr>스 <tr><td>가위</td><td>Kaut-Bullinger</td><td>M681700</td><td>정밀 가위 13 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>단면 테이프</td><td>tesa Film</td><td>57330-00000</td><td>크리스탈 클리어 테이프, 33m x 19mm</td></tr><tr><td>슬라이드 박스</td><td>GWL 보관 시스템</td><td>K50W</td><td>슬라이드 50개용 슬라이드 박스</td></tr><tr><td>스테레오 현미경 - Stemi DR1663</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀셋 - Vomm SS-SA-ESD</td><td>Eleshop</td><td>ELE002121</td><td></td></tr></tbody></table>

원자력 현미경 도출된 힘 맵에서 토착 쥐 폐 기저막의 young's modulus 추출

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

온전한 폐포 벽을 식별하고 측정한 후 이 프로토콜의 주요 결과는 BM의 필터링된 Young's modulus 값입니다. 모든 조직 절편에서 AFM 측정에 적합한 폐포 벽을 찾는 것은 불가능하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 우리의 실험적 관찰에서, 쥐 폐 표본에서 파생된 냉동 절편의 약 75%가 정량화할 수 있는 폐포 벽을 나타냈습니다. 폐 BM에서 Young's modulus의 공간 분포를 정확하게 결정하려면 3μm x 3μm 또는 4μm x 4μm에 걸친 힘 맵을 사용하는 것이 좋습니다. 이 접근 방식은 일반적으로 두께가 100nm - 200nm를 측정하는 마우스 폐 BM을 검사하기 위한 충분한 분해능을 보장합니다. 따라서 실험적 접근 방식에는 각 힘 맵에 대해 50 x 50 힘 곡선을 캡처하여 총 2,500개의 힘 곡선을 생성하는 것이 포함됩니다. 힘 맵 내에서 힘 곡선은 균일한 간격으로 배치됩니다. 이것은 BM의 Young's modulus 외에도 BM을 둘러싼 조직 구조가 작은 힘 맵에서도 조사된다는 것을 의미합니다. 따라서 폐 BM의 Young's modulus를 정확하고 선택적으로 결정하기 위해 이 프로토콜에서 2단계 필터링 프로세스를 구현했습니다.
작업자별 공간 필터링의 초기 필터링 단계는 분석된 힘 맵에 포함된 총 결과 값의 약 10%에서 25%를 포함하는 쥐 폐 BM에서 비롯된 힘 곡선 맞춤 결과를 선택합니다. 이 초기 공간 필터링 후 추가 분석을 위해 약 250 - 625개의 맞춤 결과가 유지됩니다. 다음 필터링 단계에서는 수정된 Hertz 모델에 의해 적절하게 설명된 힘 곡선에서 비롯된 BM 관련 결과만 포함되도록 합니다. 따라서 수정된 Hertz 모델 적합치의 결정 계수(R2)가 필터 기준으로 사용됩니다. 우리의 경험적 경험에 따르면R2 값이 0.96보다 높은 결과를 유지하는 것이 이 프로토콜을 준수하여 얻은 적합 결과에 적합합니다. R2 값은 힘 곡선 기준선의 품질(매끄러움)과 길이, 접촉점의 결정 및 적합 모델의 수렴에 의해 크게 영향을 받는다는 점에 유의해야 합니다. 두 필터링 절차를 모두 적용한 후 일반적으로 약 100 - 500 Young의 탄성계수 값이 단일 폐포 벽의 BM에 대해 유지됩니다.
BM에서 이러한 나머지 Young's modulus 값의 분포는 히스토그램을 사용하여 시각화할 수 있습니다(그림 4A). 폐 BM의 결과 Young's modulus 값은 양수 값만 얻을 수 있는 무작위 변수에서 일반적으로 관찰되는 로그 정규 분포를 따른다는 점에 유의하는 것이 중요합니다61. 이는 그림 4B의 QQ 플롯으로 시각화됩니다. 결과적으로, 정규(가우스) 분포는 로그 변환된 영률(E) 값의 분포에 적합될 수 있습니다. 여기서 자연 로그(ln)는 E 값을 변환하는 데 사용되었습니다. 분포(μ) 및 표준 편차(σ)의 피크 위치를 이 피팅에서 추출한 후 다음 방정식을 사용하여 EBM으로 표시되는 대표 Young's modulus를 얻기 위해 재변환했습니다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq01.jpg" style="margin: auto;">
재변환 후에는 표준 편차 간격이 더 이상 피크 값 주위에서 대칭이 아닙니다. 표준 편차 구간의 음수(σ-) 및 양수(σ+) 가장자리는 다음 표현식을 사용하여 계산할 수 있습니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq02.jpg" style="margin: auto;">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq03.jpg" style="margin: auto;">
이 방정식은 지수 함수가 자연 로그62의 역 함수라는 사실의 결과입니다.
그림 4A의 히스토그램에서 결정된 피크 값 μ = 9.31 및 표준 편차 σ = 0.18을 재변환한 후 대표적인 Young의 모듈러스 값은 표준 편차 간격이 [-1.82kPa, +2.18kPa]인 EBM = 11.05kPa입니다. 또는 로그 정규 분포를 변환되지 않은 Young의 모듈러스(E) 값의 히스토그램에 적합하여 분포의 특성 모수를 결정할 수 있습니다.
Hartmann et al.59에서 자세히 설명한 바와 같이 강력한 대표 결과를 얻기 위해 마우스당 최소 4개의 벽을 분석하는 것이 좋습니다. 마우스에 대한 대표 Young's modulus EBM 을 결정하기 위해 4개 벽 모두의 로그 변환 값을 하나의 결합된 히스토그램과 μ로 표시했으며 σ는 정규 분포를 피팅하여 결정했습니다. 이어서, μ 및 σ는 앞서 설명한 바와 같이 재형변환되어 대상 마우스에 대한 EBM 및 표준 편차 간격을 검색한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig01.jpg"> 
그림 1: 쥐 폐 기저막의 Young's modulus를 결정하기 위한 주요 프로토콜 단계의 개요. 초기 단계는 쥐의 폐를 얻어 준비한 다음 삽입하는 것입니다. 따라서 폐에 OCT 배지와 PBS의 조합을 주입한 다음 OCT 화합물에 완전히 담그십시오. 그 후, 15μm 두께의 폐 조직 절편을 냉동 절편체(cryotome)로 동결 절편을 얻습니다. 이 프로토콜에서는 절단 공정 중에 샘플을 제자리에 고정하기 위해 단면 및 양면 점착 테이프를 사용하는 프로세스를 자세히 설명합니다. 그 후, BM의 Young's modulus 값은 조직 단면에 대한 AFM 힘 맵 측정을 통해 결정됩니다. 힘 곡선 분석 프로세스가 완료되면 공간 및 R² 필터링이 적용되어 관심 구조, 특히 BM(힘 맵에서 녹색으로 표시되고 로그 변환된 Young의 모듈러스 분포에서 정량화됨)의 Young's modulus 결과를 분리합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig02.jpg"> 
그림 2: 쥐의 폐 조직 절편에 대해 수행된 예시적인 힘 맵 AFM 실험. (A) 쥐의 폐 조직 절편에 대한 명시야 현미경 개요 이미지로, 두 개의 폐포 사이에 위치한 적절한 온전한 폐포 벽을 식별할 수 있습니다. 이미지의 오른쪽에는 AFM의 삼각형 모양의 MLCT 캔틸레버 F가 보입니다. (B) 조직 단면 내에서 선택한 벽의 확대 보기. (C) 폐포 벽의 50 x 50 힘 곡선을 포함하는 개요 15 x 15 μm 맵의 기울기 및 (D) 높이 채널. 경사 채널에서 BM은 밝은 선(흰색 화살표)으로 식별될 수 있으며, 이는 벽 내에서 강성이 증가된 구조를 나타냅니다. 높이 채널은 벽의 무결성을 확인하며 파열의 증거를 보여주지 않습니다. 개요 15 x 15 μm 맵에서 BM을 식별한 후 50 x 50 힘 곡선이 있는 더 작은 4 x 4 μm 맵(E: 경사 채널, F: 높이 채널)이 기록됩니다. 눈금 막대 : (A) 200 μm 및 (BD) 25 μm. 표시된 AFM 이미지의 색상 눈금 범위는 (C) 2.36 - 9.29 nN/μm, (D) 0 - 3.38 μm, (E) 2.36 - 9.29 nN/μm (개요 이미지) 및 2.42 - 8.37 nN/μm (작은 이미지), (F) 0 - 3.38 μm (개요 이미지) 및 0 - 1.99 μm (작은 이미지)이며, 어두운 곳에서 밝은 곳까지입니다. 모든 AFM 이미지에는 선형 색상 스케일이 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig03.jpg"> 
그림 3: 공간 필터링 절차의 시각화. (A) 힘의 곡선 분석으로 인한 Young의 계수 맵으로, 결과의 공간 필터링을 가능하게 하기 위해 결과 필터링 도구에 표시됩니다. BM은 더 부드러운 조직 구획으로 둘러싸인 밝은(높은 Young's modulus 값) 줄무늬로 식별할 수 있습니다. (B) 필터링되지 않은 맵 (A)에 해당하는 Young의 모듈러스 값의 히스토그램. (C) 공간 필터 마스크(녹색 영역)를 적용한 후 (D) 히스토그램은 BM으로 식별된 녹색 강조 영역의 Young's modulus 값으로만 구성됩니다. 히스토그램의 왼쪽에서 관찰할 수 있는 잔류 소프트 값은 수렴이 불량한 피팅에 기인할 수 있으며, 이는 후속 R² 필터링 단계에서 제거됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig04.jpg"> 
그림 4: 이 프로토콜에 따라 수신된 쥐 폐 BM의 Young's modulus 분포. (A) 결과 BM Young의 계수 값(N = 325)의 로그 정규화 히스토그램. 정규 분포(검은색 실선)를 피팅하여 표준 편차가 σ = 0.18인 평균값 μ = 9.31을 결정합니다. 재변환 후, 이는 비대칭 표준 편차 간격이 [-1.82 kPa, +2.18 kPa]인 EBM = 11.05 kPa의 BM의 Young's modulus에 해당합니다. (B) QQ: 표준 정규 분포의 분위수 대비 로그화된 BM Young의 모듈러스 값의 분위수 플롯. 이 플롯은 분포의 왼쪽 꼬리와 오른쪽 꼬리에 있는 일부 값을 제외하고 결과 Young의 모듈러스 값이 주로 로그 정규 분포임을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

원자력 현미경 도출된 힘 맵에서 토착 쥐 폐 기저막의 Young's Modulus 추출

Atomic force microscopy (AFM) allows the characterization of the mechanical properties of a sample with a spatial resolution of several tens of ...

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