3차원 난포 배양을 위한 새로운 히알루로난 하이드로겔의 응용 및 마우스 난포 동결 보존을 위한 방법론

이 연구는 시험관 내 난포 성장 및 난모세포 성숙을 위한 3D 배양 시스템 개발에 중점을 두었습니다. 세포의 천연 세포외 기질의 구성 요소를 사용하여 이러한 시스템을 만들면 난포 발달이 향상됩니다. 가장 큰 과제는 동물 모델의 지식을 인간 난포 배양에 적용하는 것입니다.

인간 난소 조직에 대한 접근은 제한되어 있습니다. 그리고 인간 난포는 난자 성숙을 달성하기 위해 배양에서 훨씬 더 오랜 시간이 필요합니다. 이 연구에서 개발된 3D 배양 모델은 인간 난소 난포를 배양하는 데 특히 유용할 수 있으며, 난자 성숙을 위해 배양에 필요한 장기간 동안 3D 구조를 유지할 수 있습니다.

시작하려면 절차를 위해 10일에서 14일 된 B6D2F1 쥐 새끼의 난소를 얻으십시오. 6밀리리터의 사전 평형화된 난포 배양 배지(FCM)를 두 개의 60밀리미터 접시에 피펫팅하고 미네랄 오일을 바르고 배양합니다. 접시 중앙 웰에 콜라게나제 1밀리리터를 피펫팅하고 외부 웰에 난소 조직 또는 OT 배지 3밀리리터를 피펫팅합니다.

난소를 콜라게나제 용액으로 옮깁니다. 콜라게나제 배양이 끝나면 콜라게나제 처리된 난소를 바깥쪽 우물로 옮겨 헹굽니다. 마이크로피펫을 교체하고 난소를 OT 배지로 채워진 신선한 접시로 옮깁니다.

난포를 채취하려면 다양한 크기로 자른 피펫 팁을 통해 효소 처리된 난소 조직을 반복적으로 흡인하고 배출합니다. 27 게이지 바늘을 사용하여 조직을 기계적으로 자극하여 8개의 난포 방출을 합니다. 40배 배율의 해부 현미경으로 검사하고 온전한 기저막 안에 둘러싸인 중앙에 위치한 난모세포가 있는 2차 전전방 난포를 신선한 OT 접시에 선택합니다.

포매 과정을 시작하기 전에 FCM2 접시를 인큐베이터에 60분 동안 넣습니다. 두글씨를 위해 과산화수소가 없는 25마이크로리터의 HA 젤 두 방울을 뚜껑에 만듭니다. FCM 접시에서 포획할 모낭 또는 모낭 클러스터를 히알루론산 또는 HA 젤 한 방울로 이동하여 배양 배지를 제거하도록 헹굽니다.

FCM 접시를 버블러 아래로 다시 놓아 가스를 공급합니다. 모낭을 포매하려면 1마이크로리터의 0.03% 과산화수소 방울을 60mm 접시의 뚜껑에 놓습니다. 이제 밀리리터 HA 젤당 3밀리그램의 25마이크로리터를 넣고 섞습니다.

약 8-10마이크로리터의 HA 과산화수소 혼합물을 8웰 배양 접시의 두 개의 별도 웰에 피펫팅합니다. 그리고 난포, 난포 클러스터 또는 난소 조직 조각을 각 방울의 중앙으로 빠르게 옮깁니다. 방울 안에 거품이 없는지 확인하십시오.

3분 후, 각 웰에 100마이크로리터의 사전 평형화된 난포 배양 배지를 추가합니다. 따뜻한 사전 평형 미네랄 오일을 겹쳐 놓고 접시를 배양합니다. 유리화 공정에 필요한 장비와 용액을 준비합니다.

RI 캐리어를 액체 질소가 들어 있는 극저온 상자의 슬롯에 배치합니다. 예열된 유리화 용액 1 또는 VS1 두 방울을 상단 근처의 60mm 접시 뚜껑에 나란히 놓습니다. 이제 두 개의 모낭을 첫 번째 방울에 넣고 헹구고 VS1의 두 번째 방울로 빠르게 이동하여 5분 동안 배양합니다.

난포가 배양하는 동안 VS1 방울 바로 아래에 VS2 방울을 세 방울로 만듭니다. 그런 다음 60초 이내에 세 번의 VS2 방울을 통해 모낭을 순차적으로 빠르게 움직입니다. 유리화를 위해 VS2에서 모낭을 집습니다.

해부 범위에서 RI 캐리어를 봅니다. 그리고 초점을 조정하여 플라스틱 막대의 작은 구멍을 시각화합니다. 최소한의 체액으로 모낭을 구멍에 침착시킵니다.

플라스틱 스틱을 예식된 외부 빨대에 떨어뜨립니다. 그리고 초음파 실러를 사용하여 빨대를 닫습니다. 크라이오 지팡이에 부착된 잔에 빨대를 넣습니다.

지팡이를 플라스틱 보호 슬리브로 덮고 액체 질소에 담그십시오. 개방형 캐리어 유리화의 경우 금속 CL 스템을 자화된 바이알 캡에 삽입하여 캐리어를 준비하여 단단히 고정합니다. 극저온 바이알을 보관할 랙을 극저온 상자에 놓고 액체 질소가 바이알 상단 아래에 있는지 확인합니다.

자화된 발명 극저온 바이알에 액체 질소를 채우고 랙에 놓습니다. 마그네틱 지팡이를 사용하여 부착된 마그네틱 캡으로 CL 오픈 캐리어를 잡습니다. CL 캐리어를 별도의 VS2 방울에 담가 냉동 보호막을 만듭니다.

모든 모낭 또는 모낭 클러스터를 집어 최소한의 액체로 필름 위에 놓습니다. 액체 질소로 채워진 극저온 바이알에 CL을 즉시 담가 샘플을 비유화합니다. 크라이오 바이알을 크라이오 지팡이에 놓은 다음 플라스틱 슬리브로 덮습니다.

지팡이를 액체 질소 저장 탱크에 넣습니다. 외부 웰에 3밀리리터의 사전 평형화된 FCM이 있고 중앙 웰에 1밀리리터가 있는 중앙 웰 접시를 준비합니다. 매체에 기름을 얹은 후 접시를 버블러 아래에 놓아 가스를 공급합니다.

섭씨 37도로 미리 평형화된 0.5밀리리터의 온난화 용액 WS1 및 WS2를 라벨이 붙은 두 개의 중앙 우물 접시에 넣습니다. 저장 탱크에서 샘플이 담긴 극저온 지팡이를 액체 질소로 채워진 극저온 상자로 옮깁니다. 먼저 플라스틱 지팡이 덮개를 제거합니다.

그런 다음 빨대를 담근 상태에서 잔에서 꺼내 냉동 상자의 고정 슬롯에 밀어 넣습니다. 검은 점 바로 위의 바깥쪽 빨대를 자릅니다. 바깥쪽 빨대에서 내부 플라스틱 스틱을 들어 올리고 스틱을 WS1에 빠르게 담그고 부드럽게 소용돌이치면 10초 이내에 모낭이 내려집니다.

WS1에서 2분 후, 마이크로 피펫을 사용하여 3분 동안 배양하기 위해 난포 또는 난포 클러스터를 WS2로 옮깁니다. 그런 다음 FCM 접시로 옮기고 포매하기 전에 중앙에서 1-2시간 동안 모낭을 배양하고, 개방형 캐리어 CL 온난화의 경우 FCM 및 WS 접시 준비를 반복합니다. 크라이오 지팡이를 크라이오 상자로 옮기고 플라스틱 지팡이 덮개를 제거합니다.

마그네틱 지팡이를 사용하여 CL의 금속 스템이 보일 때까지 극저온 바이알 캡을 들어 올립니다. 마그네틱 봉을 사용하여 부착된 CL 캐리어로 캡을 잡습니다. 그리고 CL을 WS1에 빠르게 담그고 소용돌이치며 10초 이내에 모낭을 언로드합니다.

전처 난포 성장은 3차원 히알루론산 젤 배양에서 유지되어 12일째까지 전정부가 보이는 천연 난포 구조를 보존했습니다. 히알루론산 겔에 캡슐화된 난포는 배양 기간 동안 난포 직경이 약 139.8마이크로미터에서 385.6마이크로미터로 증가하는 육아증 세포 증식으로 인해 방사형 확장을 보였습니다. 배란된 중기 2개의 난모세포는 인간 융모막 성선 자극 호르몬 유발 후 난포 근처에서 발견되었습니다.

난모세포의 직경은 약 84.8마이크로미터였습니다. 신선한 난소의 경우 개별 난포와 난포 클러스터 모두 좋은 성숙률을 보였습니다. 냉동 보존된 난소의 난포 클러스터는 조기 난모세포 압출로 이어지는 낮은 성숙률을 보였습니다.

분리된 난포 동결 보존은 전체 난소 보존보다 더 효과적이었습니다. 두 캐리어의 난포 유리화는 냉각 속도 차이에 관계없이 높은 성숙률을 달성했습니다. CL 개방형 캐리어 시스템은 여러 난포의 효율적인 냉동 보존을 가능하게 하여 처리 시간을 단축했습니다.