Name: 신경재생 이미징을 위한 Channeled Agart Pads의 Caenorhabditis elegans 방향 미세 조정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 배우세요 PDMS 몰드를 이용한 홈이 있는 아가 패드 제작법으로 Caenorhabditis elegans의 방향을 정밀하게 조절하여 신경재생 연구에서 이미징 대비도를 향상시키는 방법입니다. 이 기술은 성충 동물의 스트레스를 줄이고 생리학적 조건을 유지하면서 신경 구조의 가시성을 높입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>동물 방향 제어를 위해 PDMS 금형을 사용하여 채널형 한천 패드 제작

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 48, 225-250 (1995).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-regulating+feed-forward+circuit+controlling+C-elegans+egg-laying+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A self-regulating feed-forward circuit controlling C-elegans egg-laying behavior.</a> Curr Biol. 18 (19), 1445-1455 (2008).</li>
<li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Zellag, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CentTracker%3A+a+trainable%2C+machine-learning-based+tool+for+large-scale+analyses+of+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cell+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">CentTracker: a trainable, machine-learning-based tool for large-scale analyses of Caenorhabditis elegans germline stem cell mitosis.</a> Mol Biol Cell. 32 (9), 915-930 (2021).</li>
<li>Huang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neuron+in+C.+elegans+orchestrates+multiple+motor+outputs+through+parallel+modes+of+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A single neuron in C. elegans orchestrates multiple motor outputs through parallel modes of transmission.</a> Curr Biol. 33 (20), 4430-4445.e6 (2023).</li>
<li>Rasmussen, N. R., Dickinson, D. J., Reiner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-dependent+cell+fate+decisions+are+reinforced+by+the+RAP-1+small+GTPase+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ras-dependent cell fate decisions are reinforced by the RAP-1 small GTPase in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (4), 1339-1354 (2018).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+vinyl+record%5BTitle%5D)+AND+%22MicroPubl+Biol%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a vinyl record.</a> MicroPubl Biol. 2018, (2018).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neuroscience. 7 (1), 30(2006).</li>
<li>Gerhold Abigail, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+regulation+of+stem+and+progenitor+cell+mitotic+progression+by+in+situ+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating the regulation of stem and progenitor cell mitotic progression by in situ imaging.</a> Curr Biol. 25 (9), 1123-1134 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>125 mL 에를렌마이어 플라스크</td><td>Corning</td><td>4980-125</td><td></td></tr><tr><td>33 1/2 RPM 또는 12인치 롱 플레이 (LP) 비닐 레코드&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>개별 채널 깊이: 50 &마이크로; m, 너비 : 200 & 마이크로; m</td></tr><tr><td>30 mL 플라스틱 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-793-817</td><td></td></tr><tr><td>90% 백금, 10% 이리듐 와이어</td><td>Tritech Research&nbsp;</td><td>PT-9010</td>은 플래티넘 픽 알루미늄 호일을 <td>만드는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>아마존</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL131910B</td><td></td></tr><tr><td>유리판</td><td>해당 없음</td><td>N/A</td><td>7인치 x 5인치 유리판 프레임에서 가져옴&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>는 플래티넘 픽 핫 플레이트를 만드는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>SP88857104</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA3333736</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드&nbsp;</td><td>Mckesson</td><td>938360</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 한천&nbsp;</td><td>벤치 마크 사이언티픽</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 모노베이직&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ2161022</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>사각 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-016</td><td></td></tr><tr><td>SYLCAP 284-F (빠른 치료) 실리콘 엘라스토머 봉지재 키트, 투명, 광학적으로 투명, 10:1 믹스, 500 gm/ml (0.5 kg), Sylgard 184보다 빠르고&nbsp;</td><td>MicroLubrol</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>진공 탈착기&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-648-100</td><td></td></tr><tr><td>무게 측정 접시&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>01-549-750</td><td></td></tr></tbody></table>

신경재생 이미징을 위한 channeled agart pads의 caenorhabditis elegans 방향 미세 조정

Fine Adjustment of Caenorhabditis elegans Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

PDMS 금형 제작 금형 제작 중 진공 압력을 순환하면 경화되지 않은 PDMS에서 기포에 구멍이 뚫리고 제거되어 기포가 없는 금형을 만들 수 있습니다. 그림 3D 에서 볼 수 있듯이 기포가 표면으로 올라와 구멍을 뚫습니다. 기포가 없는 금형은 깨끗한 채널을 생성할 수 있습니다.
PDMS 금형의 응고화 비닐 레코드에 유리창을 놓을 때 에어 갭을 만들지 마십시오. 이러한 갭으로 인해 두께가 고르지 않거나 표면 결함이 발생할 수 있습니다. 거품이 있는 경우 시각적으로 감지할 수 있습니다. 유리판을 한쪽에서 다른 쪽으로 누르면 공기가 변위되어 기포 형성이 최소화되고 그림 4A에 표시된 균일한 금형 두께가 보장됩니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans)의 미세한 방향을 위해 채널형 한천 패드 사용 채널링된 한천 패드는 예쁜꼬마선충의 정확한 방향을 허용합니다. 백금 와이어 픽으로 동물을 가볍게 굴려 동물의 방향을 설정하는 동시에 외음부 또는 S자형 창자와 같은 랜드마크를 사용하여 방향을 확인합니다(그림 5A, C). 그림 5B,D에 표시된 도립 현미경으로 동물을 옮기기 전에 형광 해부 현미경으로 방향을 확인합니다.
채널링된 한천 패드를 사용한 뉴런 섬유의 재생 평가 채널형 한천 패드는 동물의 방향을 최적으로 지정함으로써 신경 재생의 이미징 품질을 향상시킵니다. 재생된 뉴런 섬유를 대물렌즈에 더 가깝게 배치하면 빛의 산란과 흡수가 줄어들어 이미지 선명도가 향상됩니다. 그림 5E, F 는 재생 부위를 대물렌즈에 더 가깝게 배치하면 이미징 품질이 향상되어 신경 세포 재생에 대한 보다 정확한 분석이 용이해진다는 것을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig01.jpg"> 
그림 1: 편평하고 수로가 있는 패드에 있는 Caenorhabditis elegans . (A) DV 방향의 편평한 한천 패드에 있는 동물; 외음부는 커버슬립을 직면합니다. (B) 커버슬립 도입은 외음부를 옆으로 밀어 동물을 측면 방향으로 유도합니다. (C) DV 방향의 채널링 한천 패드에 있는 동물. (D) 동물이 커버슬립 도입 후 DV 방향으로 남아 있습니다. (E) DV 방향의 채널 한천 패드에 있는 롤러 돌연변이의 명시야 이미지. (F) 커버슬립이 있는 명시야 이미지, E 와 동일한 동물이 DV 방향으로 남아 있습니다. 약어: DV = 등쪽-복부; lat = 측면. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig02.jpg"> 
그림 2: PDMS 제조를 위한 재료 및 장비. (A) SYLCAP 284-F 실리콘 엘라스토머 키트. (B) 규모. (C) 플라스틱 주사기. (D) 진공 데시케이터. (E) 핫 플레이트. (F) 12인치 장기 재생 비닐 레코드, 필요에 따라 분해합니다. (G) 유리판. 약어: PDMS = 폴리디메틸실록산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig03.jpg"> 
그림 3: 경화되지 않은 PDMS의 혼합 및 진공 청소. (A) 트레이에 베이스와 경화제를 혼합합니다. (B) 트레이를 진공 챔버에 놓습니다. (C) 거품이 표면화될 수 있도록 진공을 세 번 순환합니다. (D) 1시간 후 대부분의 거품이 터졌습니다. PDMS를 통한 전송 개선에 유의하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig04.jpg"> 
그림 4: 기포가 없는 경화되지 않은 PDMS에 유리판 도입. (A) 거품이 없는 비닐 레코드에 유리판 도입. (B) 삽입된 디테일링 채널과 함께 기록에서 제거된 응고된 PDMS 곰팡이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig05.jpg"> 
그림 5: 수로가 있는 한천에 장착된 예쁜꼬마선충의 명시야 및 형광 이미지. (A) 양측 DV 방향의 동물의 명시야 이미지. DV 방향에 대한 해부학적 랜드마크: 코에서 꼬리까지의 거리의 정중선 ~60%를 가로지르는 나선형 S자형 창자(화살표로 표시된 어두운 조직). (B) DV 방향의 뉴런, A와 동일한 동물의 형광 이미지. (C) 위도 방향의 동물의 명시야 이미지. 위도 방향에 대한 해부학적 랜드마크: 외음부가 쪽을 향하고 있습니다. (D) 위도 방향의 뉴런, C와 동일한 동물의 형광 이미지. (E) 동물의 더 깊은(멀리) 쪽에서 재생(화살표)이 있는 방향. (F) 목표에 더 가까운 얕은 쪽 동물에서 재생이 있는 방향; 재생이 더 선명해집니다(화살표). 눈금 막대 = 20μm. 약어: DV = 등쪽-복부; lat = 측면. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

신경재생 이미징을 위한 Channeled Agart Pads의 Caenorhabditis elegans 방향 미세 조정

Caenorhabditis elegans is a model organism widely used for studying biological processes. Its transparency and small size make it ideal for imaging ...

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연구

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신경과학

예쁜꼬마선충의 실시간 이미징 중에 아가로스 패드를 사용하여 선충을 손상시키거나 건조시키지 않고 가만히 유지할 수 있습니다. 이 비디오는 현미경 검사를 위한 간단한 장착 패드를 준비하는 방법을 설명합니다.

선충 슬라이드 준비: 한천 패드에 동물을 장착하는 방법

출처: Doser, R., et al. 생체 내 신경 칼슘 처리의 세포 내 이미징. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주의 복부 신경 코드 뉴런에서 세포내 칼슘 플럭스의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 두 가지 별개의 칼슘 지표가 사용됩니다: 한 균주의 세포질 지표와 다른 균주의 미토콘드리아 지표. 뉴런은 자발적인 뉴런 활동 중 칼슘 플럭스를 반영하여 뉴런 세포질 및 미토콘드리아 내 형광 강도의 실시간 변화를 모니터링하기 위해 형광 현미경으로 관찰됩니다.

Caenorhabditis elegans의 뉴런에서 세포내 칼슘 역학 이미징

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신경재생 이미징을 위한 Channeled Agart Pads의 Caenorhabditis elegans 방향 미세 조정

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