Fine Adjustment of <em>Caenorhabditis elegans</em> Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

Tina Thuy N. Nguyen Hoang; Chirayu P. Sanganeria; Samuel H. Chung

doi:10.3791/67811

신경재생 이미징을 위한 Channeled Agart Pads의 Caenorhabditis elegans 방향 미세 조정

JoVE Journal
Neuroscience

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JoVE Journal Neuroscience

Fine Adjustment of Caenorhabditis elegans Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

신경재생 이미징을 위한 Channeled Agart Pads의 Caenorhabditis elegans 방향 미세 조정

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05:12 min

January 31, 2025

DOI: 10.3791/67811-v

Tina Thuy N. Nguyen Hoang¹, Chirayu P. Sanganeria¹, Samuel H. Chung¹

¹Department of Bioengineering,Northeastern University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for creating channeled agar pads using PDMS molds from vinyl records. The aim is to better orient Caenorhabditis elegans for enhanced imaging contrast, specifically in neuroregeneration research. The approach addresses challenges associated with imaging adult C. elegans by maintaining their orientation and reducing stress during observation.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Neuroregeneration
Imaging Techniques

Background

The laboratory focuses on mechanisms of mammalian central nervous system regeneration.
C. elegans serves as a model organism for studying neuronal regeneration.
Challenges include air bubbles and inconsistent mold thickness in PDMS creation.
Adult C. elegans have issues with imaging due to size and pigmentation.

Purpose of Study

To fabricate molds that allow for precise orientation of C. elegans.
To improve imaging quality of neuronal structures during regeneration.
To facilitate better cell targeting through controlled animal placement.

Methods Used

Use of PDMS molds for creating channeled agar pads.
C. elegans serves as the biological model organism.
The method allows the reuse of PDMS molds and includes important preparation steps for consistent results.
Critical steps include thorough mixing, vacuum desiccation, and careful pouring of solutions.

Main Results

Channeled agar pads improved the orientation of C. elegans, aligning crucial anatomical landmarks.
Fluorescent imaging validated proper orientation and enhanced visibility of neuronal structures.
Regenerated neuron fibers were positioned closer to the imaging objective, minimizing scattering.

Conclusions

This study demonstrates a New methodology for enhancing imaging of C. elegans in neuroregeneration studies.
The use of channeled agar aids in maintaining physiological relevance and improving visualization.
These advancements facilitate better understanding of neuronal regeneration mechanisms.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using channeled agar pads?

Channeled agar pads enhance the imaging quality of C. elegans by ensuring proper orientation and reducing stress on the animals, which promotes consistent physiological conditions.

How are PDMS molds created?

PDMS molds are made by mixing a fast cure agent with the base, followed by careful vacuum desiccation and curing at high temperatures to ensure uniform thickness.

What imaging techniques are utilized in this study?

Fluorescent dissecting and inverted microscopy are used to verify the orientation and enhance the visibility of neuronal structures within C. elegans.

What challenges are addressed by this protocol?

The protocol addresses issues such as air bubble formation and maintaining consistent mold thickness, which can hinder accurate imaging of C. elegans.

Can the PDMS molds be reused?

Yes, once created, the PDMS molds can be reused multiple times for creating channeled agar pads, making the process efficient.

How does this method contribute to understanding neuroregeneration?

By improving imaging techniques, this method allows for a better analysis of neuronal regeneration processes in C. elegans, providing insights into mammalian CNS regeneration mechanisms.

여기에서는 비닐 레코드에서 만든 PDMS 몰드를 사용하여 채널형 한천 패드를 제작하는 프로토콜을 제시합니다. 이 채널을 통해 사용자는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )의 방향을 미세하게 조정하여 이미징 대비를 개선하고 구조를 쉽게 비교할 수 있습니다. 이러한 기능은 신경 재생 연구에서 특히 유용합니다.

우리 연구실의 주요 초점은 모델 유기체인 C.elegans를 사용하여 포유류 중추 신경계 재생의 기저에 있는 메커니즘을 정의하는 것입니다. 우리는 여러 뉴런에 걸친 재생을 연구하고 향상된 중추 신경계 재생으로 이어지는 사전 조절 신호의 정체를 찾습니다. 현재 실험적 과제에는 비닐 레코드의 유리판을 교체하는 동안 기포를 도입하고 균일한 금형 두께를 얻는 것이 포함됩니다.

그러나 PDMS 금형이 생성되면 조에 재사용할 수 있습니다. 우리가 다루고 있는 연구 격차는 성인 동물의 방향에 대한 제한된 통제입니다. 다 자란 동물은 직경이 더 크고 착색이 더 많아 더 깊은 Z 평면에서 이미징하는 데 문제가 있습니다.

또한 커버 슬립 도입은 초기 방향도 변경합니다. 이 채널은 커버 슬립 도입 시 동물의 방향을 유지하는 데 도움이 되어 표적 세포가 이미징 목표에 더 가까이 다가갈 수 있도록 합니다. 또한 이 채널은 동물에 대한 스트레스를 줄여 정상적인 생리학을 촉진하고, 선형 동물 구성을 장려하며, 여러 동물에 대한 이미징 시 일관성을 생성합니다.

시작하려면 베이스에 대한 속경화제를 1:10 비율로 일회용 계량 접시에 붓습니다. 경화되지 않은 액체가 완전히 통합되고 거품이 가득 찰 때까지 45초 동안 완전히 혼합합니다. 그런 다음 경화되지 않은 PDMS 혼합물이 들어 있는 트레이를 진공 데시케이터에 비스듬히 놓습니다.

-0.09 킬로 파스칼과 마이너스 0.1 킬로 파스칼 사이의 압력을 세 번 순환하여 기포가 표면화되도록 합니다. 비닐 레코드와 유리판을 탈이온수로 철저히 헹구고 비닐 레코드를 공기 중에서 완전히 건조시킨 후 더 사용하십시오. 핫 플레이트 위에 알루미늄 호일 시트를 놓아 과도한 PDMS를 잡아냅니다.

그런 다음 비닐 레코드의 양쪽 끝에 유리 슬라이드를 배치하여 금형 두께를 설정하고 경화되지 않은 PDMS에 유리판을 누를 때 높이가 균일하도록 합니다. 이제 경화되지 않은 PDMS 액체를 비닐 레코드의 한쪽 면에 붓습니다. 유리판을 기울여 천천히 아래로 내려 갇힌 공기가 빠져나갈 수 있도록 합니다.

그런 다음 섭씨 100도에서 20분 동안 PDMS를 치료합니다. 핫 플레이트에서 비닐 레코드를 제거하고 식히십시오. 그런 다음 비닐 레코드에서 PDMS를 조심스럽게 떼어내어 찢어지지 않도록 합니다.

그런 다음 유리창에서 PDMS를 떼어냅니다. 새 유리 슬라이드를 가이드로 사용하여 날카로운 면도기로 PDMS를 절단하여 채널형 한천 주형을 만듭니다. 여분의 PDMS를 벗겨 최종 절단 채널 한천 곰팡이를 보여줍니다.

플라스크에 한천 0.6g과 선충 성장 배지 액체 스톡 30ml를 추가합니다. 플라스크에 교반 막대를 넣고 섭씨 120도로 설정된 핫 플레이트에서 혼합물을 가열합니다. 젤이 녹은 후 120마이크로리터의 아지드화나트륨 원액을 추가합니다.

그런 다음 PDMS 금형을 물로 철저히 세척하고 자연 건조시킵니다. PDMS 금형을 두 세트의 슬라이드 쌍 사이에 배치하여 사용할 준비를 합니다. 피펫을 사용하여 한천 용액을 위아래로 끌어당겨 피펫 팁과 피펫 300마이크로리터의 용융된 한천을 PDMS 금형에 가열합니다.

마지막으로 현미경 슬라이드를 한천에 직접 놓고 측면의 슬라이드에 놓이도록 합니다. 한천이 완전히 냉각된 후 슬라이드를 제거하십시오. 채널형 한천 패드는 도립 현미경으로 옮기기 전에 형광 해부 현미경으로 확인된 외음부 및 S자형 창자와 같은 랜드마크를 정렬하기 위해 동물을 굴려 Caenorhabditis elegans의 정확한 방향을 촉진했습니다.

형광 이미징은 형광 현미경 사진에서 볼 수 있듯이 채널된 한천 패드에서 Caenorhabditis elegans의 올바른 방향을 확인했습니다. 채널형 한천 패드는 재생된 뉴런 섬유를 대물렌즈에 더 가깝게 배치하여 빛의 산란 및 흡수를 최소화함으로써 신경 재생을 위한 이미징 품질을 향상시켰습니다.