Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning을 위한 새롭고 효율적인 방법

제 연구실에서는 초파리 모델을 사용하여 노화 및 대사 장애를 연구하고, 대사 질환, 심장 근육, 수면 및 기타 노화 질환에 대한 중재로 시간 제한 섭식 및 운동을 연구합니다. 생리학적, 유전적 및 영양 전략을 활용한 기계 학습 및 오믹은 3D 프린팅 장치와 기계 학습 접근 방식을 사용하여 초파리 분석을 간소화하고 있습니다. 초파리 심장의 형광 면역조직화학은 유전자형과 연령에 걸쳐 다중 단백질을 검출할 수 있지만 복잡한 해부, 조직 보존 및 특정 단백질 발현 패턴의 고해상도 이미징과 같은 문제에 직면해 있습니다.

이 프로토콜은 조직 보존, 항체 침투 및 이미징 해상도를 개선하여 심장 단백질 마커를 더 잘 시각화할 수 있습니다. 복잡한 해부, 조직 손상 및 전통적인 전체 심장 마운트 방법의 제한된 해상도와 같은 문제를 해결합니다. 이 프로토콜은 복잡한 해부를 제거하고, 한 손으로 실행할 수 있으며, 비용이 많이 드는 컨포칼 현미경 검사를 피하여 고해상도 이미징을 보다 실현 가능하게 함으로써 초파리 심장 연구의 접근성을 향상시킵니다.

시작하려면 이산화탄소 파리 매트를 사용하여 5-10마리의 파리를 마취합니다. 현미경으로 1X에서 2X 배율로 파리를 시야 내에 배치합니다. 봄 가위를 사용하여 파리의 목을 자르고 날개를 자르고 다리를 제거합니다.

흉부와 복부를 함께 유지하는 것을 몸체라고 합니다. 브러시를 사용하여 모든 실험 그룹이 수집될 때까지 얼음 위의 1.5ml 튜브라고 표시된 튜브에 시체를 부드럽게 넣었습니다. 얼음에서 튜브를 제거한 후 pH 8의 100밀리몰 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 100마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다.

모든 물체가 물에 잠겼는지 확인하고 튜브를 궤도 셰이커에 10분 동안 놓습니다. 그런 다음 튜브에서 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 용액을 제거하고 버립니다. 각 튜브에 PBS 100마이크로리터를 피펫팅하여 10분 동안 조직을 세척합니다.

세척 과정에서 튜브를 오비탈 셰이커에 놓습니다. PBS를 버린 후 PBS 용액에 100 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드를 각 튜브에 피펫팅합니다. 튜브를 100 유닛의 궤도 쉐이커에 15분 동안 놓고 조직이 용액과 접촉한 상태를 유지하도록 합니다.

그런 다음 파라포름알데히드 용액을 버립니다. 최종 세척이 완료되면 시체를 PBS의 10% 자당 용액으로 옮깁니다. 본체가 튜브 내의 용액과 접촉하고 있는지 확인하십시오.

창고에서 드라이 아이스를 꺼내 작은 금속 또는 플라스틱 트레이에 넣을 몇 조각을 선택하십시오. 금형을 삽입할 수 있는 치수의 트레이를 선택하고 하나의 크고 평평한 드라이아이스 조각 위에 직접 놓습니다. 라벨이 붙은 금형을 최적의 절단 온도 또는 OCT 화합물로 50%까지 채우고 기포를 최소화하기 위해 천천히 붓습니다.

브러시를 사용하여 절개 및 고정 된 초파리 본체를 금형 내의 OCT 화합물 표면에 조심스럽게 놓습니다. 집게를 사용하여 흉부와 복부의 등벽이 일반적으로 바닥을 따라 정렬되도록 각 몸을 금형의 바닥으로 밀어 넣습니다. 복부가 금형 바닥을 따라 평평하게 놓이도록 몸체를 조정합니다.

X, Y 및 Z 치수의 모든 본체를 정렬하여 각 섹션에 모든 주제가 동시에 포함되도록 합니다. 특히 남성의 경우 복부의 곡률을 수정하여 몸에 구멍을 내거나 짓누르지 않고 가능한 한 평평하게 만듭니다. 모든 피험자가 제자리에 놓이면 바닥이 드라이아이스 조각 바로 위에 놓이도록 틀을 배치합니다.

OCT 화합물이 접촉 시 동결되기 시작하고 모든 피험자가 곰팡이에 완전히 갇힐 때까지 계속합니다. 냉동 후 금형을 섭씨 영하 20도로 설정된 냉동고로 옮겨 전체적으로 완전히 얼도록 합니다. 완전히 얼면 금형의 나머지 부분을 OCT 화합물로 채웁니다.

척 비트를 금형에 부착하려면 블록에 OCT 화합물을 넉넉하게 도포하십시오. 비트를 화합물에 평평하게 누르고 일반적으로 5분 이내에 저온 유지 장치에서 완전히 동결되도록 합니다. 그런 다음 척 비트와 OCT 블록을 금형에서 분리합니다.

비트를 척에 넣고 블록이 위에서 아래로 올바른 방향을 유지하는지 확인하고 척 키를 조여 비트를 고정합니다. 이제 조정 손잡이와 척 깊이 컨트롤을 사용하여 블록을 블레이드에 정렬하고 단면 너비를 20마이크로미터 이하로 설정합니다. 느리지만 일관된 동작을 사용하여 블록에서 각 조각을 자르면 롤 방지 유리가 절단될 때 각 조각을 캡처할 수 있습니다.

데워진 슬라이드를 사용하여 섹션을 수집합니다. 면도날로 섹션을 둘러싼 여분의 OCT 화합물을 제거합니다. 소수성 마커를 사용하여 각 슬라이드의 테두리를 윤곽을 그려 세척 및 염색 용액을 조직에 국한시킵니다.

1000마이크로리터 피펫을 사용하여 티슈를 건드리지 않고 PBS로 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 세척합니다. 최종 세척을 버린 후 형광 염색 용액을 조직에 피펫으로 바르고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 형광 얼룩을 버리고 PBS로 슬라이드를 5분씩 3회 세척합니다.

그런 다음 최종 PBS 세척을 버리고 슬라이드에 소량의 용액을 남깁니다. 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 피펫으로 장착 매체를 슬라이드에 3-5방울 떨어뜨려 조직에 직접 도포하지 않도록 합니다. 집게를 사용하여 커버 슬립을 한쪽 가장자리에 놓고 슬라이드와 같은 높이가 될 때까지 다른 쪽을 서서히 내립니다.

네온이나 반짝이가 없는 매니큐어로 슬라이드를 밀봉합니다. 장착 매체가 경화되지 않으면 형광 염색에 따라 즉시 이미지를 만들거나 나중에 사용할 수 있도록 슬라이드를 보관하십시오. 이미징하기 전에 슬라이드의 청결 상태를 검사하고 물에 70% 에탄올이 함유된 티슈 천을 사용하여 부드럽게 청소하십시오.

실험 내에서 가장 밝은 형광 피사체를 분석하여 각 형광 채널에 대한 적절한 노출 시간을 선택합니다. 모든 채널에 대한 라이브 뷰에서 각 실험 그룹을 조사하여 올바른 노출 설정을 확인합니다. 일관성을 위해 동일한 형광 채널을 사용하여 각 피사체에 초점을 맞추고 모든 피사체에 대한 이미지를 캡처합니다.

이미징 후 나중에 이미지를 다시 캡처할 수 있도록 섭씨 4도의 어둠 속에 슬라이드를 보관하십시오. 형광 이미징 방법은 ostia, valve, longitudinal fiber 및 circumferential fibers와 같은 초파리 심장의 주요 특징을 보존했습니다. 전체 심장관 구조와 세부적인 작은 구조는 서로 다른 배율로 캡처되었으며, 전체 구조에 대해 10X, 원주 수축 섬유 및 세로 안정화 섬유와 같은 더 미세한 세부 사항을 보여주는 40X에서 60X 배율로 캡처되었습니다.

대표적인 형광 현미경 사진은 dapi 염색 핵, 녹색으로 염색된 지질, 팔로이딘으로 빨간색으로 염색된 액틴 함유 근섬유가 있는 w1118 초파리에서 보존된 심장 구조를 보여주었습니다. Phalloidin 염색은 세로 및 둘레 섬유를 효과적으로 강조하여 동결 및 절단 응력에도 불구하고 보존된 액틴 필라멘트 구조를 보여주었습니다. 지질 반점 염색은 심장관 근처에 국한된 지방 저장을 드러냈습니다.