Name: Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 학습하세요 비만 연구를 위한 콜라게나제와 DNase를 이용한 성숙 지방세포 분리법. 이 프로토콜은 생체 특성을 유지한 채 다양한 지방 조직에서 세포를 분리하여 기능 연구에 활용할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>기능 및 이미징 연구를 위한 쥐 지방세포 및 외식세포 배양

<ol><li>Ward, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+U.S.+state-level+prevalence+of+adult+obesity+and+severe+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity.</a> N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Longo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+as+determinant+of+obesity-associated+metabolic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications.</a> Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+Adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Johnston, E. K., Abbott, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+paracrine-%2C+autocrine-%2C+and+matrix-dependent+signaling+during+the+development+and+progression+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity.</a> Cells. 12 (3), 407(2023).</li>
<li>Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+adipose+tissue+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction.</a> Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+and+lipidomic+profiling+of+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissues+in+15+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates.</a> Sci Data. 10 (1), 453(2023).</li>
<li>Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-to-breast+cancer+crosstalk%3A+Comprehensive+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights.</a> Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Nahmgoong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+properties+of+adipose+stem+cell+subpopulations+determine+fat+depot-specific+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics.</a> Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue at single-cell resolution.</a> Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+breast+tumorigenesis+through+taz-dependent+secretion+of+resistin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).</li>
<li>Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+liver-visceral+adipose+axis+during+hepatic+resection+and+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation.</a> Cells. 8 (9), 1100(2019).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-alpha-2-glycoprotein+secreted+by+triple-negative+breast+cancer+promotes+peritumoral+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis.</a> Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+repertoire+of+human+adipocyte+subtypes+develops+from+transcriptionally+distinct+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+human+white+adipocytes+cultured+under+membranes+maintain+identity%2C+function%2C+and+can+transdifferentiate+into+brown-like+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes.</a> Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).</li>
<li>Chaurasiya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+adipose+tissue+microvascular+endothelial+cell+isolation+and+establishment+of+co-culture+with+white+adipocytes+to+analyze+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication.</a> Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+pre-adipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice.</a> J Vis Exp. 167, e62005(2021).</li>
<li>Farrar, J. S., Martin, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+and+subsequent+differentiation+into+white+or+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes.</a> Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).</li>
<li>You, X., Gao, J., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+to+mechanically+isolate+stromal+vascular+fraction%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review.</a> Regen Ther. 27, 120-125 (2024).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+isolation+from+mouse+epididymal+adipose+tissue+and+sequencing+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).</li>
<li>Cho, D. S., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+adipose+progenitor+cells+from+mouse+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues.</a> J Vis Exp. 162, e61694(2020).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+human+adipose+tissue+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Next-generation human adipose tissue culture methods.</a> Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).</li>
<li>Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+mature+adipocytes+using+membrane+mature+adipocyte+aggregate+cultures+%28MAAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC).</a> J Vis Exp. 156, e60485(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Poloxamer 188 용액</td><td>Sigma</td><td>P5556-100mL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔</td>형 <td>Cellstar</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>21 G 바늘</td><td>BD</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6.5 mm Transwell with 0.4 &micro; m 기공 폴리카보네이트 멤브레인 인서트</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500gm</td><td></td></tr><tr><td>CellMask 플라즈마 멤브레인 염색</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>CL 316243 디소듐 염</td><td>Tocris</td><td>1499</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 분말</td><td>시그마</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 페놀 없음 Red</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A56708-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td>1518848</tr><tr><td>젤 로딩 피펫 팁</td><td>Fisher scientific</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 분석 키트</td><td>Abcam</td><td>AB133130</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma</td><td>83264-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R 원심분리기</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75004271</tr><tr><td>Hoechst 33342 솔루션</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이팅 미니 셰이커</td><td>VWR</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>미디엄 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 안경</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>SecureSeal 이미징 스페이서</td><td>Grace Biolabs</td><td>654006</td><td></td></tr><tr><td>Seive (SteeL 미세 메쉬 칵테일 여과기)</td><td>OXO</td><td>3112000</td><td>https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html</td></tr></tbody></table>

isolation and culturing of primary murine adipocytes from lean and obese mice

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

그림 2에서 볼 수 있듯이 적절한 다지기(그림 2B)와 소화(그림 2C)는 온전한 성숙 지방세포를 분리하는 데 중요합니다. 다지기가 부족하고 소화가 부족하면 결합 조직과의 부적절한 분리로 인해 성숙한 지방 세포의 수율이 낮아질 수 있습니다. 육안적으로, 이것은 다진 후 남아 있는 끈적끈적한 조직과 콜라겐분해효소 용액에 눈에 보이는 덩어리로 관찰할 수 있습니다. 또한 과도하게 다지고 과도하게 소화되면 성숙한 지방 세포가 터져 수율이 낮아집니다. 시각적으로 이것은 백색 불투명 층의 손실과 크고 투명한 유리 지질 층의 축적을 초래합니다. 부적절한 수준의 다지기나 소화는 지방 세포를 제대로 분리하지 못하게 합니다.
지방 조직의 적절한 준비와 소화는 그림 3에서 볼 수 있듯이 조직을 4개의 별개의 층으로 분리하는 결과를 낳습니다. 유리 지질의 방출을 초래하는 지방 세포의 일부 파열은 불가피합니다. 그러나 적절한 다지기와 소화는 지방 세포 파열을 최소화합니다. 남아 있는 유리 지질층과 배지는 지방 세포를 패킹하는 동안 제거됩니다(그림 4). 지방세포의 적절한 패킹은 성숙한 지방세포의 효율적인 분리에 필수적입니다. 남아 있는 유리 지질 또는 배지는 분리 불량을 초래하고 도금, 지방 분해 및 세포 이미징과 같은 다운스트림 기능 분석에 부정적인 영향을 미칩니다.
이 프로토콜은 성숙한 지방 세포의 깨끗한 준비를 생성합니다. 세포 이미징 및 지방 분해 분석을 수행하여 세포 기능을 평가하고 성숙한 지방 세포가 분리 후 및 최대 2주 동안 배양 후에도 기능을 유지한다는 것을 입증할 수 있습니다. 지방 분해 분석법은 성숙한 지방 세포가 β-3 아드레날린 수용체의 자극 시 유리 글리세롤의 방출을 통해 세포 신호에 반응하는 능력을 유지한다는 것을 나타냅니다(그림 6A, B). 이 능력은 배양에서 2주 후에도 유지되며 24시간 동안 배양된 지방 조직 외식의 지방 분해 활성과 매우 유사합니다(그림 6C, D). 품질이 좋지 않은 지방세포는 약독화된 지방분해를 보여줍니다. 분리된 지방세포의 세포 이미징은 하나의 큰 지질 방울을 포함하는 둥글고 손상되지 않은 단안구 성숙한 지방세포를 보여줍니다. 품질이 좋지 않은 지방세포 분리는 주로 지방 세포 파열을 나타내는 큰 세포 외 기름 방울을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig01.jpg"> 
그림 1: 지방 조직 이식의 포매 . (A) 조직을 포매팅하기 전에 부분적으로 응고된 기저막 매트릭스 돔의 이미지. (B) 부적절하거나 적절한 조직 포매의 대표 이미지. 부적절한 포매는 조직이 돔 위에 부분적으로 또는 완전히 떠 있는 것처럼 보이기 때문에 볼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig02.jpg"> 
그림 2: 지방 조직의 적절한 다진 및 소화 스키마. (A) 조직 다진 및 소화 단계의 개략도 4.2-4.6. (B) 부족 조직, 최적 조직 및 과도하게 다진 조직의 대표 이미지. 덜 다진 조직에는 원래 모양을 유지하는 큰 덩어리가 있습니다. 과도하게 다진 조직은 조직을 둘러싼 유리 지질이 눈에 띄게 증가하여 투명하고 기름진 것처럼 보입니다. (C) 과소 소화된 조직, 최적 조직 및 과소화된 조직의 대표 이미지. 소화가 덜 된 조직에는 용액에 남아 있는 전체 조직 덩어리가 포함되어 있습니다. 과도하게 소화된 조직은 용액에서 빠르게 분리되는 큰 유리 지질층을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig03.jpg"> 
그림 3: 소화된 지방 조직의 층 분리. (A) 5.3단계에 따라 존재하는 레이어의 개략적이고 대표적인 이미지. (B) 절단된 피펫 팁을 사용하여 50mL 원추형 튜브에서 성숙한 지방 세포층을 제거합니다. (C) 성숙한 지방세포층 아래에서 배양 배지를 제거하기 위한 바늘과 주사기의 적절한 기술과 배치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig04.jpg"> 
그림 4: 성숙한 지방세포의 순차적 패킹. 성숙한 지방세포를 포장하는 순차적 이미지. 유리 지질, 지방 세포 및 배지의 층이 표시되어 있습니다. 각 스핀 후에 유리 지질과 배지가 제거됩니다. 이것은 스핀 후 배지 또는 유리 지질이 지방 세포에서 분리되지 않을 때까지 반복됩니다. 최종 이미지는 잘 채워진 성숙한 지방 세포를 대표합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig05.jpg"> 
그림 5: 성숙한 지방세포의 도금 및 배양. (A) 성숙한 지방세포의 도금도. 절단된 p200 피펫 팁을 사용하여 패킹된 지방 세포를 세포 배양 삽입체의 멤브레인에 놓습니다. 그런 다음 인서트를 미리 채워진 배양 배지 웰로 반전시킵니다. (B) 트랜스웰 인서트에 지방세포를 증착하는 절단 피펫 팁을 묘사한 도금 성숙 지방세포의 대표적인 이미지. (C) 웰 위에서 본 바와 같이 트랜스웰로 도금된 적절하게 충전된 지방세포와 제대로 충전되지 않은 지방세포의 개략도 및 대표 이미지. 적절하게 채워진 지방세포는 하얗고 불투명하게 보이는 반면, 제대로 채워지지 않은 지방세포는 투명한 지질 방울을 형성합니다. (D) 배양 배지를 변경하는 데 사용되는 기술의 개략도. p200 피펫 팁은 트랜스웰 인서트의 측벽에 있는 구멍을 통해 매체를 조심스럽게 제거하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig06.jpg"> 
그림 6: 성숙한 지방세포의 이미징 및 지방분해 분석. (A,B) 피하(A) 및 내장(B) 성숙한 지방 세포에서 글리세롤 방출. 지방세포는 정상적인 차우 식단을 먹인 16주 된 C57BL/6 수컷 마우스에서 분리되었습니다. 30 μL의 지방 세포를 단계 7.1에 기재된 바와 같이 도말하고, 1일 또는 10일 동안 배양하였다. 지방세포는 1시간, 2시간, 4시간 동안 5μM의 CL-316,243으로 처리하고, 상등액을 채취하여 유리 글리세롤을 분석하였다. (씨,디) 피하(C) 및 내장(D) 지방 조직 이식에서 글리세롤 방출. 지방 조직은 정상적인 차우 식단을 먹인 18주 된 C57BL/6 암컷 쥐에서 분리되었습니다. 0.1g의 지방 조직 외식을 3.1-3.4 단계에 기재된 바와 같이 도금하고 24시간 동안 배양하였다. 지방세포는 1시간, 2시간, 4시간 동안 5μM의 CL-316,243으로 처리하고, 상등액을 채취하여 유리 글리세롤을 분석하였다. N = A-D에 대한 3번의 기술적 반복실험. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차입니다. (E) 분리된 피하 및 내장 성숙 지방 세포의 대표 이미지. 지방세포는 정상적인 차우 식단을 먹인 16주 된 C57BL/6J 수컷 마우스에서 분리되었습니다. 지방세포는 원형질막 염색(빨간색) 및 Hoechst 핵 염색(파란색)으로 염색했습니다. 눈금 막대 : 50 μm; 배율: 60배. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>성</td>
			<td>다이어트</td>
			<td>창고</td>
			<td>민싱 난이도</td>
			<td>콜라겐 분해 효소 : 조직 비율</td>
			<td>권장 소화 시간(분)</td>
			<td>스핀 온도.</td>
			<td>세탁 온도.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">여성</td>
			<td rowspan="2">일반 차우</td>
			<td>피하의</td>
			<td>힘들다</td>
			<td>2:1</td>
			<td>12</td>
			<td>RT (RT)</td>
			<td>37 기음</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>내장</td>
			<td>보통</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT (RT)</td>
			<td>37 기음</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">고지방 다이어트</td>
			<td>피하의</td>
			<td>쉬운</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT (RT)</td>
			<td>37 기음</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>내장</td>
			<td>쉬운</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT (RT)</td>
			<td>37 기음</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">남성</td>
			<td rowspan="2">일반 차우</td>
			<td>피하의</td>
			<td>힘들다</td>
			<td>2:1</td>
			<td>14</td>
			<td>4 기음</td>
			<td>RT (RT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>내장</td>
			<td>보통</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 기음</td>
			<td>RT (RT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">고지방 다이어트</td>
			<td>피하의</td>
			<td>쉬운</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 기음</td>
			<td>RT (RT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>내장</td>
			<td>쉬운</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 기음</td>
			<td>RT (RT)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 성별, 디포 및 다이어트에 따른 수정. 각 조직의 다진 난이도는 다른 저장소와 관련하여 "쉬움", "중간" 또는 "어려움"으로 설명됩니다. 실제 다진 시간은 연구자와 조직에 따라 다릅니다. 콜라겐 분해 효소 : 조직 중량 (g)에 대해 4.1 단계에서 제조 된 콜라겐 분해 효소 + DNase 용액의 부피 (mL)로 나열된 조직 비율. 소화 시간은 대략적인 추정치이지만 실제 소화 시간은 다진 것과 조직에 따라 다릅니다. 연구자는 프로토콜에 설명된 대로 소화를 평가해야 합니다. 스핀 온도와 세척 온도는 수컷 마우스와 암컷 마우스마다 다릅니다. RT는 실내 온도를 나타냅니다.

Adipose tissue is primarily composed of mature, lipid-laden adipocytes by volume. These postmitotic cells play a critical role in energy storage and ...

본 연구는 다양한 지방 저장소와 식이 조건에서 성숙한 지방 세포의 기능을 조사하는 데 중점을 두고 있습니다. 우리는 특히 성숙한 지방세포가 주변 세포와 어떻게 소통하는지, 그리고 이 누화가 질병 진행에 어떻게 영향을 미치고 비만에 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 데 관심이 있습니다. 성숙한 지방세포는 크고 섬세한 세포이기 때문에 FACS와 같이 일반적으로 사용되는 세포 분리 방법이 비효율적입니다.더욱이, 지방 조직에서 흔히 발견되는 높은 수준의 유리 지질은 성숙한 지방 세포에 독성이 있어 유지를 복잡하게 만들 수 있습니다. 지방세포의 체외 분화에 의존하는 일반적으로 사용되는 방법과 달리, 이 프로토콜을 사용하면 생체 내 지방세포와 유사한 기능적으로나 전사적으로 유사한 체외 분리 지방세포를 연구할 수 있습니다. 이는 지방 세포가 지방 저장소와 식단 조건에 따라 크게 다르기 때문에 특히 중요합니다.이 프로토콜은 성숙한 지방 세포를 효율적으로 분리하고 미러링하며 쉽게 확장할 수 있습니다. 다른 성별과 다른 식이 조건을 가진 마우스에서 지방 세포의 분리를 최적화하기 위한 조정이 포함됩니다. 일단 분리되면 지방 세포는 배양, 이미징 또는 필요에 따라 사용할 수 있습니다.먼저 콜라겐 분해 효소 용액 1ml당 0.00017g의 DNase를 첨가하여 DNase가 포함된 콜라겐 분해 효소 용액을 준비하고 혼합물을 와류로 만들어 완전한 혼합을 보장합니다. 면도날을 사용하여 고립된 쥐의 지방 조직이 균질하게 보일 때까지 다집니다. 그런 다음 다진 조직을 멸균된 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.준비된 콜라겐 분해 효소와 DNase 용액을 다진 지방 조직에 넣고 최대 속도로 7-10초 동안 와류를 일으켜 성분을 완전히 혼합합니다. 그런 다음 50ml 원뿔형 튜브를 섭씨 37도에서 220RPM으로 설정된 셰이커에 10분 동안 수평으로 놓습니다. 배양 후 튜브를 제거하고 5 초 동안 와류를 제거하고 샘플을 확인하십시오.이제 혈청학 피펫을 사용하여 소화된 조직을 체를 통해 새로운 멸균 50ml 원추형 튜브에 통과시킵니다. 체를 통해 조직과 콜라겐 분해 효소 용액의 부피와 동일한 FBS를 동일한 원추형 튜브에 첨가하여 콜라겐 분해 효소를 중화합니다. 여기에 표시된 표에 지정된 온도에서 300G에서 튜브를 3분 동안 돌립니다.그런 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 유리 지질의 최상층을 조심스럽게 버립니다. 다음으로, 끝이 잘린 P1000 피펫을 사용하여 성숙한 지방 세포를 10ml의 성장 배지가 들어 있는 준비된 15ml 튜브로 옮깁니다. 흰색 층이 배지 전체에 분산될 때까지 성숙한 지방 세포가 들어 있는 15ml 튜브를 3-5회 부드럽게 뒤집습니다.튜브를 10분 동안 휴지시킨 후 미리 결정된 온도에서 튜브를 회전시켜 층을 더 분리합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 유리 지질의 최상층을 버리십시오. 이제 21 게이지 바늘을 5 밀리리터 주사기에 부착하고 바늘 바닥이 성숙한 지방 세포 부위 층 아래에 올 때까지 바늘을 튜브 가장자리 아래로 조심스럽게 밀어 넣습니다.그런 다음 주사기를 천천히 당겨 배양 배지와 세포 파편을 제거합니다. 튜브에 10ml의 배양 배지를 부드럽게 추가합니다. 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 팁을 튜브 가장자리 아래로 밀어 성숙한 지방 세포층 아래에서 나머지 배지를 제거합니다.그런 다음 100G에서 1분 동안 세포를 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 유리 지질을 제거합니다. 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 지방 세포 아래의 배양 배지를 제거합니다.조직 배양 처리된 24웰 플레이트에서 세포 배양 삽입물을 제거하고 멤브레인 면이 위로 향하도록 후드 표면에 놓습니다. 접시의 교대 웰을 따뜻한 배양 배지로 채웁니다. 절단된 P200 피펫 팁을 사용하여 30마이크로리터의 포장된 성숙한 지방 세포를 Transwell 인서트 상단으로 옮깁니다.그런 다음 Transwell 인서트를 조심스럽게 집어 뒤집어 24웰 플레이트의 미리 채워진 웰에 넣습니다. 웰에서 매체를 제거하려면 Transwell 인서트를 안정적으로 잡고 측면의 작은 구멍을 통해 P200 피펫으로 흡입합니다. 매체를 제거한 후 Transwell을 제자리에 고정한 상태에서 웰 측벽을 따라 1ml의 새 매체를 천천히 추가합니다.

isolation-culturing-primary-murine-adipocytes-from-lean-obese

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

때문에 비만 및 다른 동반 질환의 급격한 음의 연결, 역할 지방에 대한 연구는 질병에 재생 및 전반적인 건강을 보증합니다. 우리는 고립과 현장에서 사용하여 지방의 연구를 허용 지방 창고의 절제 및 생체 외 방법에 프로토콜을 제시한다.

현지화, 식별 및 절제 쥣과 지방이 종점의

막 성숙한 지방세포 골재 배양(MAAC)은 성숙한 인간 지방세포배양하는 새로운 방법이다. 여기서 우리는 인간의 지방에서 지방세포를 분리하는 방법과 MAAC를 설정하는 방법을 자세히 설명합니다.

인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

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이 보고서는 신생아 마우스에서 1 차적인 갈색 및 백색 프레드포스세포의 동시 적인 격리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 분리된 세포는 배양에서 재배되고 완전히 성숙한 백색과 갈색 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 이 방법은 배양시 1차 지방세포의 유전적, 분자 및 기능적 특성화를 가능하게 한다.

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

이 연구는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 갈색 지방 세포를 분리하는 새로운 방법을 설명합니다.

유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 견갑골 갈색 지방 조직에서 갈색 지방 세포 분리

이 프로토콜은 피하 지방에서 마우스 지방전구세포의 분리, 성숙한 지방세포로의 분화 및 인슐린 저항성 유도를 설명합니다. 인슐린 작용은 웨스턴 블롯을 통한 인슐린 신호 전달 경로 구성원의 인산화/활성화에 의해 평가됩니다. 이 방법을 사용하면 원발성 지방세포에서 인슐린 저항성/민감도를 직접 측정할 수 있습니다.

1차 배양에서 분화된 마우스 지방세포: 인슐린 저항성 모델

여기서는 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도를 설명하여 혈관 주위 지방 조직 기능 및 혈관 세포와의 관계를 연구할 수 있습니다.

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)

체외 이식 모델을 사용하여, 저지방 쥐의 내장 백색 지방 조직의 앞부분 일부를 7일에서 10일간 배양하여, 고지방 식이 섭취 중 지방 조직 염증을 유도하고 연구할 수 있게 합니다.

고지방 식이와 유사한 지방 조직 염증을 위한 체외 마우스 모델

여기, 우리는 murine 폐동맥 내피 세포의 격리와 문화 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 정비사 및 효소 폐 조직 분리뿐만 아니라 안티 - PECAM - 1과 대부분 microvascular 원산지 순수한 내피 세포 인구를 생산 자성 비즈에 복합 백신 ICAM - 2 항체를 사용하여 2 단계 정화 과정으로 구성됩니다.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

이 보고서에서는 종양에 침투 leukocytes의 고도 정화 인구를 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 복잡한 종양 조직에서 세포를 분리에 대한 수율과 순도를 향상시키기 위해 Miltenyi 생명 공학 프로토콜에서 적응하고 있습니다.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

학습하세요 비만 연구를 위한 콜라게나제와 DNase를 이용한 성숙 지방세포 분리법. 이 프로토콜은 생체 특성을 유지한 채 다양한 지방 조직에서 세포를 분리하여 기능 연구에 활용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

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