Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

본 연구는 다양한 지방 저장소와 식이 조건에서 성숙한 지방 세포의 기능을 조사하는 데 중점을 두고 있습니다. 우리는 특히 성숙한 지방세포가 주변 세포와 어떻게 소통하는지, 그리고 이 누화가 질병 진행에 어떻게 영향을 미치고 비만에 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 데 관심이 있습니다. 성숙한 지방세포는 크고 섬세한 세포이기 때문에 FACS와 같이 일반적으로 사용되는 세포 분리 방법이 비효율적입니다.

더욱이, 지방 조직에서 흔히 발견되는 높은 수준의 유리 지질은 성숙한 지방 세포에 독성이 있어 유지를 복잡하게 만들 수 있습니다. 지방세포의 체외 분화에 의존하는 일반적으로 사용되는 방법과 달리, 이 프로토콜을 사용하면 생체 내 지방세포와 유사한 기능적으로나 전사적으로 유사한 체외 분리 지방세포를 연구할 수 있습니다. 이는 지방 세포가 지방 저장소와 식단 조건에 따라 크게 다르기 때문에 특히 중요합니다.

이 프로토콜은 성숙한 지방 세포를 효율적으로 분리하고 미러링하며 쉽게 확장할 수 있습니다. 다른 성별과 다른 식이 조건을 가진 마우스에서 지방 세포의 분리를 최적화하기 위한 조정이 포함됩니다. 일단 분리되면 지방 세포는 배양, 이미징 또는 필요에 따라 사용할 수 있습니다.

먼저 콜라겐 분해 효소 용액 1ml당 0.00017g의 DNase를 첨가하여 DNase가 포함된 콜라겐 분해 효소 용액을 준비하고 혼합물을 와류로 만들어 완전한 혼합을 보장합니다. 면도날을 사용하여 고립된 쥐의 지방 조직이 균질하게 보일 때까지 다집니다. 그런 다음 다진 조직을 멸균된 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

준비된 콜라겐 분해 효소와 DNase 용액을 다진 지방 조직에 넣고 최대 속도로 7-10초 동안 와류를 일으켜 성분을 완전히 혼합합니다. 그런 다음 50ml 원뿔형 튜브를 섭씨 37도에서 220RPM으로 설정된 셰이커에 10분 동안 수평으로 놓습니다. 배양 후 튜브를 제거하고 5 초 동안 와류를 제거하고 샘플을 확인하십시오.

이제 혈청학 피펫을 사용하여 소화된 조직을 체를 통해 새로운 멸균 50ml 원추형 튜브에 통과시킵니다. 체를 통해 조직과 콜라겐 분해 효소 용액의 부피와 동일한 FBS를 동일한 원추형 튜브에 첨가하여 콜라겐 분해 효소를 중화합니다. 여기에 표시된 표에 지정된 온도에서 300G에서 튜브를 3분 동안 돌립니다.

그런 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 유리 지질의 최상층을 조심스럽게 버립니다. 다음으로, 끝이 잘린 P1000 피펫을 사용하여 성숙한 지방 세포를 10ml의 성장 배지가 들어 있는 준비된 15ml 튜브로 옮깁니다. 흰색 층이 배지 전체에 분산될 때까지 성숙한 지방 세포가 들어 있는 15ml 튜브를 3-5회 부드럽게 뒤집습니다.

튜브를 10분 동안 휴지시킨 후 미리 결정된 온도에서 튜브를 회전시켜 층을 더 분리합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 유리 지질의 최상층을 버리십시오. 이제 21 게이지 바늘을 5 밀리리터 주사기에 부착하고 바늘 바닥이 성숙한 지방 세포 부위 층 아래에 올 때까지 바늘을 튜브 가장자리 아래로 조심스럽게 밀어 넣습니다.

그런 다음 주사기를 천천히 당겨 배양 배지와 세포 파편을 제거합니다. 튜브에 10ml의 배양 배지를 부드럽게 추가합니다. 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 팁을 튜브 가장자리 아래로 밀어 성숙한 지방 세포층 아래에서 나머지 배지를 제거합니다.

그런 다음 100G에서 1분 동안 세포를 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 유리 지질을 제거합니다. 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 지방 세포 아래의 배양 배지를 제거합니다.

조직 배양 처리된 24웰 플레이트에서 세포 배양 삽입물을 제거하고 멤브레인 면이 위로 향하도록 후드 표면에 놓습니다. 접시의 교대 웰을 따뜻한 배양 배지로 채웁니다. 절단된 P200 피펫 팁을 사용하여 30마이크로리터의 포장된 성숙한 지방 세포를 Transwell 인서트 상단으로 옮깁니다.

그런 다음 Transwell 인서트를 조심스럽게 집어 뒤집어 24웰 플레이트의 미리 채워진 웰에 넣습니다. 웰에서 매체를 제거하려면 Transwell 인서트를 안정적으로 잡고 측면의 작은 구멍을 통해 P200 피펫으로 흡입합니다. 매체를 제거한 후 Transwell을 제자리에 고정한 상태에서 웰 측벽을 따라 1ml의 새 매체를 천천히 추가합니다.