2025년 6월 13일
이 방법은 리간드를 제시하는 고정된 DNA-듀플렉스를 파열시켜 상대적인 세포 견인력을 보고하는 세포의 경향을 측정합니다. 파열된 형광 올리고는 세포로 전달되어 유세포 분석으로 분석되어 세포의 기계적 이력을 기록합니다. 이를 통해 세포 메카노피노타이핑(cellular mechanophenotyping)의 맥락에서 세포력 생성에 대한 고처리량 측정이 가능합니다.
우리 연구실은 일반적으로 세포가 기계적 자극을 전달하는 데 사용하는 분자 메커니즘을 연구합니다. 최근에는 세포가 주변 환경에 가하는 힘을 측정하여 기계생물학을 오믹스 시대로 끌어들이기 위해 고처리량 방법을 개발하고 있습니다. 연구에 따르면 T 세포가 올바른 항원에 의해 활성화되는 방법과 줄기 세포가 특수 세포 유형으로 분화하는 방법에 기계적 힘이 관련되어 있습니다.
최근에는 조절 장애 세포 역학의 기저에 있는 프로세스를 표적으로 삼는 것이 질병을 치료하는 수단으로 메크나anotherapeutics의 개발로 이어졌습니다. DNA 듀플렉스 및 헤어핀 센서는 세포 외의 힘을 측정하며, 유전적으로 암호화된 센서는 세포 내 측정을 가능하게 합니다. 거의 모든 것이 고급 현미경을 필요로 합니다.
견인력 현미경 검사는 세포가 주변 환경에 가하는 힘을 측정할 수 있지만 고해상도 이미징도 포함됩니다. 우리는 이 작업에서 이 분야의 세 가지 과제를 해결하는데, 하나는 이미징 대신 힘 측정을 위해 유세포 분석을 사용하는 것이고, 두 번째는 HOH 태그 기술을 사용하여 리간드와 항체를 DNA 프로브에 부착하는 것, 셋은 특별한 표면 처리 없이 표준 세포 배양 플레이트를 사용하는 것입니다. 세포 생성 힘의 변화가 질병 상태에 대한 예후 마커로 어떻게 사용될 수 있으며, 이러한 힘은 질병 상태에 기여합니까, 아니면 해당 질병 상태의 2차 효과입니까?
시작하려면 담금질이 있는 앵커 가닥과 형광단이 있는 리간드 가닥의 1.1:1 몰 비율로 듀플렉스를 조립합니다. 용액에서 40 마이크로몰 리간드 가닥의 최종 농도에서 듀플렉스를 준비합니다. 조립된 듀플렉스를 어닐링하려면 섭씨 98도에서 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 혼합물을 빛에서 멀리 떨어진 실온에서 1시간 동안 식힙니다. 어닐링 단계에서 가장 적게 풍부한 가닥의 농도를 사용하여 어닐링된 듀플렉스를 HUH와 반응시키며, 이 경우 리간드 가닥입니다. 10 마이크로몰 듀플렉스 및 20 마이크로몰 HUH의 최종 농도에서 1 대 2 몰 비율로 듀플렉스를 HUH와 혼합합니다.
섭씨 37도에서 열 순환기 또는 빛 보호 열 블록에서 30분 동안 반응을 배양합니다. 배양 후 열에 대한 반응을 제거하고 탁상형 미니 원심분리기를 사용하여 현재 조립된 장력 게이지 테더(TGT)를 회전시킵니다. TGT가 적절하게 부착되면 PBS로 원하는 세포로 웰을 세 번 세척합니다.
그런 다음 무혈청 매체를 사용하여 두 번 세척하고 최종 세척 후 배지를 웰에 그대로 둡니다. 가장자리 효과를 완화하기 위해 주변 웰에 200마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮겨 플레이트를 예열합니다.
그런 다음 약 80% confluency에서 관심 있는 셀을 검색합니다. 배지를 흡인한 다음 PBS로 세포를 세척하고 세포가 해리될 때까지 섭씨 37도에서 트립신으로 세포를 배양하는데, 이 과정은 약 5분에서 10분이 소요됩니다. 세포가 해리되면 세포를 유지하는 데 사용되는 전체 세포 배지의 원래 부피를 추가합니다.
혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 재현탁하고 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 300G에서 4분 동안 세포를 원심분리합니다. 매체를 흡입하고 PBS에서 펠릿을 재현탁합니다.
원심분리를 반복한 후 5ml의 무혈청 배지에 세포를 재현탁시키고 다시 원심분리합니다. 약 2mL의 무혈청 배지에서 세포를 흡인하고 재현탁합니다. 재현탁된 세포의 밀도를 측정하여 원하는 대로 농도를 조정합니다.
선택적으로, 약물 효과를 테스트하는 경우 세포에 적절한 농도의 약물을 추가하고 진행하기 전에 사전 배양 시간 동안 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 이제 인큐베이터에서 원래 플레이트를 회수하고 실험용 웰의 세척에서 남은 잔류 매체를 제거합니다. 원하는 배지와 피펫으로 웰을 한 번 세척하고 재현탁 세포 100마이크로리터를 원하는 웰에 넣습니다.
도금된 세포를 90분 동안 인큐베이터로 옮깁니다. 배양 후 각 웰에서 약 125-170 마이크로 리터의 부피를 제거합니다. 필요한 경우 200마이크로리터의 따뜻한 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.
그런 다음 세포가 해리되기 시작할 때까지 각 웰에 있는 세포를 50마이크로리터의 트립신으로 배양하는데, 이 과정은 약 5-10분이 소요됩니다. 다음으로, 갓 준비된 160마이크로리터의 흐름 버퍼를 각 웰에 추가합니다. 세포를 해리하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
이 세포 현탁액 196마이크로리터를 PCR 튜브에 옮기고 4마이크로리터의 프로피듐 요오드화물을 첨가한 다음 부드럽게 혼합합니다. 마지막으로, 뚜껑이 있는 얼음 양동이에 튜브를 넣고 빛을 차단하고 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 측정합니다. 유세포 분석 게이팅은 성공적인 살아있는 단일 세포 분리를 확인하여 정확한 기계형 분석을 보장했습니다.
Cy5-A 형광의 99번째 백분위수에 설정된 음성 대조군 게이팅은 실험 조건 비교를 위한 기준선을 제공했습니다. Y27632로 처리된 CHO-K1 세포는 전단 TGT에서 음성 대조 게이트를 초과하는 세포의 비율이 유의하게 감소한 반면, TGT의 지퍼를 풀면 미미하고 통계적으로 유의하지 않은 감소만 나타났습니다. TGT의 지퍼를 풀면 TGT를 전단하는 것과 비교하여 음성 대조군을 초과하는 세포의 비율이 일관되게 높아져 더 낮은 힘 요구 사항을 확인했습니다.
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이 연구는 리간드 제시 고정 DNA 이중체의 세포 파열 경향을 측정하는 방법을 제시하며, 이는 상대적인 세포 견인력을 보고합니다. 이 접근법은 세포 힘 생성의 고처리량 측정을 가능하게 하여, 메카노바이올로지 분야에 기여합니다.
High-throughput flow cytometry measurement of cellular mechanotype using DNA tension probes enables scalable quantification of cell-generated forces, addressing a key bottleneck in mechanobiology-driven drug discovery. This approach supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for diseases where cell mechanics are disrupted. Integrating force measurement into early discovery pipelines enhances portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions.
This method positions cellular force quantification at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical research, enabling mechanotype-based triage and mechanistic insight throughout the pipeline.