Name: 고효율 플라스미드 구조를 위한 In Vivo Assembly 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 학습하세요 고효율 플라스미드 클로닝을 위한 in vivo assembly 방법을. E. coli의 DNA 복구 효소를 활용하여 전문 효소 없이 99%의 클로닝 효율을 달성하고 항생제 내성 세균 연구에 활용할 수 있습니다.

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<ol><li>Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertero%2C+A+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22">Basic Science Methods for Clinical Researchers</a>. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).</li>
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<li>Engler, C., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Golden Gate cloning.</a> Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).</li>
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<li>Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+multiple+DNA+fragments+through+direct+transformation+of+PCR+products+into+E.+coli+and+Lactobacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus.</a> Plasmid. 76, 40-46 (2014).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+rearrangement+of+plasmid+DNA+during+transformation+of+Escherichia+coli+with+linear+plasmid+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intramolecular+recyclization+and+deletion+formation+following+transformation+of+Escherichia+coli+with+linearized+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).</li>
<li>Sung, W. L., Zahab, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+directed+by+single-stranded+crossover+linkers%3A+specific+deletion+of+the+amino-terminal+region+of+the+beta-galactosidase+gene+in+pUC+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22DNA%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids.</a> DNA. 6 (4), 373-379 (1987).</li>
<li>Mandecki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+double-strand+break+repair+in+plasmids+of+Escherichia+coli%3A+a+method+for+site-specific+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).</li>
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<li>Wallace, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+of+synthetic+oligodeoxyribonucleotides+to+phi+chi+174+DNA%3A+the+effect+of+single+base+pair+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch.</a> Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).</li>
<li>Bzymek, M., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+repetitive+DNA+sequences%3A+The+role+of+replication+in+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inoue+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+E.+coli%3A+%26%2334%3Bultra-competent%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: &#34;ultra-competent&#34; cells.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Fürste, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+plasmid+RP4+primase+region+in+a+multi-host-range+tacP+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector.</a> Gene. 48 (1), 119-131 (1986).</li>
<li>Bäumler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+iron+regulated+locus+of+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi.</a> Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).</li>
<li>Godiska, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+plasmid+vector+for+cloning+of+repetitive+or+unstable+sequences+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).</li>
<li>Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+DNA+assembly+using+common+laboratory+bacteria%3A+A+re-emerging+tool+to+simplify+molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning.</a> J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA ladder</td><td>FroggaBio</td><td>DM015-R500</td><td>DNA 분자량 마커</td></tr><tr><td>AccuReady M 단일 채널 0.5-10 &마이크로; L</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPP020</td><td>액체 전송을 위한 피펫</td></tr><tr><td>AccuReady M 단일 채널 피펫터 키트</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPK100</td><td>액체</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003.1</td><td>성장 매체를 위한 응고제</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td> DNA 전기영동 Biometra TOne<td>를 위한 아가로스 젤 만들기</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Analytikjena</td><td>846-2-070-301</td><td></td></tr><tr><td>유리 배양 튜브용</td> 열순환 캡 <td>Fisher Scientific</td><td>14-957-91</td><td>유리 배양 튜브용 재사용 가능한 캡</td></tr><tr><td>DNA 프라이머</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td>PCR 반응에서 템플릿 DNA를 바인딩하고 증폭</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>PCR 증폭 후 Cleave 메틸화 템플릿 DNA</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>제한 효소, 적절한 완충액</td></tr><tr><td>제공 Eppendorf microtubes 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td>Microtube, 1.5 mL, 원뿔형 베이스, PP, 부착된 플랫 캡, 성형 눈금 및 젖빛 필기 공간</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL0748203</td><td>DNA 시각화/삽입제, 독성</td></tr><tr><td>EZ-10 스핀 컬럼 플라스미드 DNA Miniprep Kit</td><td>Biobasic</td><td>BS614</td><td>하룻밤 사이에 세균 배양에서 플라스미드 DNA를 분리</td></tr>하십시오 <tr><td>GelDoc Go-Gel 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>12009077</td><td>이미징 DNA 젤</td></tr><tr><td>유리 배양 튜브 Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-925E</td><td>유리 배양 튜브</td></tr><tr><td>myGel&nbsp; 미니 전기영동 시스템</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z742288</td><td>젤 전기영동에 사용되는 시스템</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>DNA 농도 결정</td></tr><tr><td>PCR 클린업 DNA 시퀀싱</td><td>Biobasic</td><td>BT5100</td><td>Purify PCR 제품&nbsp;</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.011</td><td>페트리 접시 92 x 16 mm, PS, 투명, 환기 캠 포함</td></tr><tr><td>피펫 팁, 1000 &마이크로; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.305</td><td>100-1000 &micro용 피펫 팁; L</td></tr><tr><td>피펫 팁, 2.5 &마이크로; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3010.265</td><td>최대 2.5 &micro용 피펫 팁; L</td></tr><tr><td>피펫 팁, 20 &마이크로; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3020.200</td><td>최대 20 & 마이크로용 피펫 팁; L</td></tr><tr><td>피펫 팁, 200 & 마이크로; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.020</td><td>1-200 및 마이크로용 피펫 팁; L</td></tr><tr><td>Salt (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>세균 성장 배지의 구성 요소 (10 g/L)</td></tr><tr><td>플랫 캡이 있는 단일 0.2 mL PCR 튜브</td><td>FroggaBio</td><td>TF-1000</td><td>PCR 튜브</td></tr><tr><td>트립톤(세균학)</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402.5</td><td>박테리아 성장 배지의 구성 요소(10 g/L)</td></tr><tr><td>VeriFi DNA 중합효소</td><td>PCR Biosystems</td><td>PB10.42-01</td><td>Mg2+ 및 dNTPs를 포함하는 PCR 완충액은 구매</td></tr><tr><td>Xba</em</td>과 함께 제공됩니다>I <td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>제한 효소, 적절한 완충액 효</td></tr><tr><td>모 추출물</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401.205</td><td>박테리아 성장 배지의 구성 요소(5g/L)</td></tr>와 함께 제공됩니다.</tbody></table>

고효율 플라스미드 구조를 위한 in vivo assembly 사용

Use of In Vivo Assembly for High-efficiency Plasmid Construction

이 원고에서는 IVA 사용의 예로, 제공된 IVA 워크플로우를 따라 mCherry open reading frame을 plasmid pSU19의 다중 클로닝 부위에 재복제하여 pSU19mCherry와 동일한 plasmid를 생성했습니다(그림 3)17. IVA에 적합한 프라이머는 프로토콜 단계 1.1 및 1.2를 기반으로 설계되었습니다. 그런 다음 플라스미드 분리 키트를 사용하여 pSU19 및 pSU18mCherry를 분리했으며, 이는 각각 플라스미드 골격을 증폭하고 DNA를 삽입하기 위한 PCR 반응의 템플릿 역할을 했습니다(프로토콜 단계 2.1). pSU19 플라스미드 골격은 PCR-증폭되었고(프라이머 쌍: pSU19_F: TAGGGTACCGAGCTCGAATTC 및 pSU19_R CCCGGGGATCCTCTAGAGTC), mCherry 오픈 리딩 프레임은 pSU18mCherry(프라이머 쌍 mCherry_F: ctctagaggatcc...

고효율 플라스미드 구조를 위한 In Vivo Assembly 사용

In vivo assembly (IVA) is a molecular cloning method that uses intrinsic enzymes present in bacteria that promote intermolecular recombination of DNA ...

use-of-in-vivo-assembly-for-high-efficiency-plasmid-construction

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

미리 만든 수용체의 직전 되나 상륙 패드 종자에 관심있는 외국의 DNA를 통합하는 신속하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 ΦC31 integrase의 활용과 표현을 통해 주어진 변형율의 공학 상륙 패드 현장에 DNA 카세트의 특정 사이트 통합을 허용합니다.

사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

출처: Tomás, JM, et al. 박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 null 돌연변이체의 생성. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 대장균  에서 자살 플라스미드의 개시자 의존적 증폭을 보여줍니다.항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드는 숙주에 의해 암호화된 개시제 단백질이 있는 경우에만 복제됩니다. 전기천공 및 회수 배지에서 배양한 후, 혼합물을 항생제 함유 한천에 도금합니다. 플라스미드를 가진 박테리아는 개시제 단백질이 플라스미드의 항생제 내성 유전자를 발현할 수 있기 때문에 생존합니다.

박테리아 숙주에서 자살 플라스미드의 증폭

유전자 표적화 방법론을 사용하여 knockout, knock-in 및 tagged 대립유전자가 있는 형질전환 마우스를 생성할 수 있습니다.  여기에서는 E. coli에서 재조합하는 개선된 방법, 즉 'subcloning plus insertion'이라고 하는 재조합 방법을 설명하며, 이는 맞춤형 유전자 표적화 벡터를 빠르게 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법

맞춤형 플라스미드의 합성은 노동과 시간이 많이 소요됩니다. 이 프로토콜은 맞춤형 DNA 클로닝 절차의 작업과 기간을 줄이기 위해 Gibson 어셈블리 클로닝을 사용하는 방법을 설명합니다. 설명된 프로토콜은 또한 기존의 cut-and-paste DNA 클로닝과 유사한 비용으로 포유류 발현을 위한 신뢰할 수 있는 태그가 지정된 단백질 구조를 생성합니다.

플라스미드 벡터를 생성 깁슨 어셈블리를 사용하여 인간의 신장 요인-1α의 발기인의 규정에 따라 FLAG-태그 단백질을 표현

징크 핑거 도메인은 본질적으로 세포 투과성 및 포유 동물 세포 유형 내로 다양한 단백질 전달을 매개 할 수있다. 여기서, 단백질의 세포 내 전달을위한 아연 핑거 기술을 구현하기위한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

여기, 제한 효소 사이트를 동의어 DNA 시퀀스에 삽입 및 기능 플라스미드 복구를 기반으로하는 프로토콜 인 플라스미드 회수 및 제한 효소 사이트 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.

카스트레 : 플라스미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입에 의한 키메라 조립

여기, 선물이 공동 표현 공상 RNA 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하 여 많은 양의 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜 tRNA 리가. 주요 제품은 동질성을 정화를 용이 하 게 원형 분자 이다.

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

이 프로토콜의 목표는 골든 게이트 복제를 기반으로 모듈형 복제 시스템을 사용하여 다중 유전자 구조를 조립하기위한 상세한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 또한 우리의 경험을 바탕으로 최적의 어셈블리를 보장하기 위한 중요한 단계에 대한 권장 사항을 제공합니다.

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

이 기사에서는 모듈러 클로닝(MoClo)이 폴리시스트로닉 오페론의 클로닝에 어떻게 적용될 수 있는지 보여주는 단계별 프로토콜을 제시합니다.

In-Cloning 툴킷을 사용한 MoClo(Polycistronic Operons with Modular Cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리

본 연구는 염색체 서열이 이미 알려져 있거나 관심 없는 플라스미드의 나노포어 시퀀싱 워크플로우를 설명합니다. 초기 플라스미드 DNA 풍부화 단계는 최적의 플라스미드 서열 깊이를 보장하고 플로우 셀당 시퀀싱 가능한 샘플 수를 극대화합니다.

나노포어 시퀀싱 기반 워크플로우를 이용한 롱리드 플라스미드 시퀀싱 및 조립

학습하세요 고효율 플라스미드 클로닝을 위한 in vivo assembly 방법을. E. coli의 DNA 복구 효소를 활용하여 전문 효소 없이 99%의 클로닝 효율을 달성하고 항생제 내성 세균 연구에 활용할 수 있습니다.

고효율 플라스미드 구조를 위한 In Vivo Assembly 사용

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