Multi-color 유세포분석법을 통한 혈소판 하위 모집단 분석

우리의 연구는 혈전증, 염증 및 질병 특정 맥락에서 역할, 활성화 패턴 및 임상적 관련성을 이해하는 것을 목표로 다색 유세포 분석을 사용하여 혈소판 하위 집단을 식별하고 특성화합니다. 혈소판 작용제는 뚜렷한 활성화 패턴을 유도하고 콜라겐 관련 펩타이드와 비교하여 응고 촉진제 및 하위 집단을 생성하는 것을 관찰할 수 있는 확립된 다색 유세포 분석 분석입니다. 다색 분석을 통해 단일 튜브에서 분리된 인간 혈소판 집단 내에서 단일 혈소판의 혈소판 활성화, 접착, 응집 및 세포사멸 가능성을 동시에 측정할 수 있습니다.

[강사] 시작하려면 절차에 필요한 모든 시약을 준비하십시오. 이제 10x Tyrode의 완충액 10밀리리터와 증류수 90밀리리터를 섞습니다. 포도당 0.1g을 넣고 헤페스로 전체 부피의 pH를 조절하여 7.4에 도달합니다. 먼저 완충액 10ml의 pH를 7.4로 설정한 다음 나머지 90ml의 pH를 일반 염산 1개로 6.5로 조절합니다. 혈액 샘플 수집을 위해 각 기증자에 대해 ACD 항응고제 2밀리리터와 함께 10밀리리터 주사기를 준비합니다. 주사기를 실온에서 평형을 유지하십시오. 예열된 ACD 주사기에 기증자 혈액을 채취한 후 ACD 처리] 혈액을 15밀리리터 반응 튜브로 천천히 옮깁니다. ACD 처리된 혈액을 209G에서 휴식 시간을 사용하지 않고 실온에서 20분 동안 원심분리합니다. 한편, 50밀리리터 반응 튜브에 pH 6.5의 Tyrode's Hepes 완충액 25밀리리터를 준비합니다. 원심분리 후, 상부 혈소판 풍부 혈장층을 Tyrode's Hepes 완충액이 들어 있는 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 오염을 방지하려면 버피 코트와 적혈구층 위에 약 1밀리리터의 혈소판 풍부 혈장을 남겨 두십시오. 그런 다음 현탁액을 실온에서 10분 동안 430G에서 원심분리하여 혈소판을 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 pH 7.4로 조정된 200-300마이크로리터의 Tyrode 완충액에 혈소판 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다. pH 7.4에서 Tyrode의 Hepes 완충액을 사용하여 마이크로리터당 200,000개의 혈소판으로 조정하기 전에 세포 계수기를 사용하여 혈소판 수를 측정합니다. CD61, CD42B, CD41, CXCR7 및 CXCR4를 포함하여 염색 전에 활성화가 필요하지 않은 수용체의 경우 항체당 1개의 염색되지 않은 샘플과 1개의 염색된 샘플을 준비합니다. PAC-1, CD63, CD62P, NXN5 및 좀비 NIR과 같은 활성화가 필요한 수용체 또는 마커용. CRPXL 밀리리터당 10마이크로그램으로 샘플을 활성화하고 활성화된 샘플과 활성화되지 않은 샘플을 모두 준비합니다. 혈소판을 활성화하려면 CRPXL 밀리리터당 10마이크로그램과 함께 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 분리된 혈소판을 다양한 농도의 형광색소색 접합 항체와 함께 배양하거나 30분 동안 죽입니다. 그런 다음 각 샘플에 300마이크로리터의 아넥신 결합 완충액을 첨가하여 희석합니다. 유세포 분석기를 사용하여 각 샘플에 대해 10,000개의 이벤트를 측정합니다. 각 항체의 염색 지수를 계산하여 양성 집단과 음성 집단 간의 최적 분리를 결정합니다. 각 항체에 대한 최적의 농도를 식별하기 위해 항체 농도에 대한 염색 지수를 플로팅합니다. 염색을 위해 헤멘 분말을 1.4M 수산화나트륨에 용해시켜 3M 용액을 만듭니다. 용액을 섭씨 96도에서 분당 450회전으로 5분 동안 가열합니다. 증류수로 희석하여 3밀리몰 줄기 용액을 얻습니다. 혈소판 수를 샘플당 100만 혈소판으로 조정한 후 앞서 설명한 대로 혈소판을 활성화합니다. 각 샘플에 43.3마이크로리터의 항체 칵테일을 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, pH 7.4에서 10밀리몰 Hepes 수산화나트륨으로 구성된 결합 완충액에 1개의 X 및 X 300마이크로리터로 각 샘플을 희석합니다. 유세포 분석기를 사용하여 염색된 각 샘플을 즉시 측정합니다. 비드로 보상하려면 각 형광단에 대해 150마이크로리터의 PBS를 준비하고 비드 1방울과 형광 접합 항체 1마이크로리터를 추가합니다. 아넥신 V를 보상하기 위해, 아넥신 V와 동일한 형광단에 접합된 항인간 CD 62L로 표지된 PECY7B 7개의 비드를 사용한다. 150마이크로리터의 PBS에 양성 비드 2방울과 음성 비드 1방울을 1마이크로리터의 다이와 혼합하여 아민 반응성 염료에 아민 반응성 보상 비드를 사용한다. 양극 비드가 반응하여 신호를 표시하고 음극 비드가 반응하지 않는지 확인합니다. 모든 마커에 대해 형광에서 하나의 대조군을 뺀 값을 준비합니다. 산점도는 혈소판 인구의 명확한 변화를 보여주었습니다. 헤민은 다른 작용제보다 전방 산란이 낮은 더 많은 혈소판을 형성합니다. ADP 트롬빈과 CRPXL로 치료한 결과 40-60%의 혈소판이 CD42 양성인 반면 헤민은 이 집단을 크게 감소시켰습니다. 모든 혈소판 작용제는 CD41 및 CD61 표면 발현에 영향을 미치지 않았습니다. 헤멘만이 CXCR4 및 CXCR7 표면 발현을 유의하게 증가시켰습니다. 또한, 헤민 처리 하에서 포스파티딜세린 노출도 향상되어 아넥신 V 양성 세포가 향상되었습니다. UMAP 및 페놀 그래프 분석은 작용제 유형에 따라 달라지는 27개의 뚜렷한 혈소판 클러스터를 정의했습니다. 헤민은 클러스터 패턴에 가장 극적인 변화를 일으켰습니다. 휴식 혈소판 하위 집단은 ADP로 가장 많이 보존되었고 헤민과 함께 임대되었습니다.