Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH: Drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출

우리의 연구는 세포가 게놈 내의 여러 리보솜 DNA 유전자좌를 어떻게 감지, 모니터링 및 조절하는지 이해하는 데 중점을 둡니다. 구체적으로, 우리는 어떤 rDNA 유전자좌가 활발하게 전사되고 이러한 유전자좌가 개별적으로 어떻게 조절되는지를 구별하는 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 합니다. 우리는 최근에 세포 내 rDNA의 양이 시간이 지남에 따라 변할 수 있으며, 이러한 변화로 인해 전사되는 rDNA 자리가 변경된다는 것을 발견했습니다.

이제 우리는 세포가 가지고 있는 rDNA의 양에 따라 rDNA 전사가 변경된다는 것을 이해합니다. 이 발견은 세포가 얼마나 많은 RDA를 가지고 있는지 어떻게 알 수 있는지, 그리고 어떤 rDNA 유전자 자리가 발현을 선호하는지 어떻게 결정하는지 질문하게 합니다. 우리 연구실은 현재 세포가 서로 다른 rDNA 유전자좌를 구별하고 그 활동을 감지하고 조절하는 데 사용하는 메커니즘을 이해하는 데 중점을 두고 있습니다.

실체현미경으로 초파리를 해부하여 RNase-free PBS에서 고환을 분리합니다. 시작하려면 한 쌍의 집게로 복부 중앙을 잡고 다른 쌍으로 복부 끝을 잡고 동물을 부드럽게 잡아당깁니다. 겸자를 사용하여 해부 접시에서 분리된 고환을 0.5ml의 RNase-free PBS가 들어 있는 1.5ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.

PBS를 흡인하고 1ml의 고정 용액을 추가합니다. 샘플을 실온의 너트 쉐이커에 30분 동안 놓습니다. 배양 후 고정 용액을 흡인합니다.

그런 다음 너트 셰이커에서 1ml의 PBS로 샘플을 각각 5분 동안 두 번 세척합니다. PBS를 흡인시킨 후 RNase-free 70% 에탄올 1ml를 추가하고 너트 쉐이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 에탄올을 흡인하고 샘플에 1ml의 세척 버퍼를 추가합니다.

시료를 실온의 너트 쉐이커에 3분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 2분 동안 똑바로 세웁니다. 프로브와 마스크를 혼성화 버퍼와 혼합하여 여기에 표시된 대로 샘플당 총 100마이크로리터의 부피를 준비합니다.

그런 다음 세척 버퍼를 흡입한 후 샘플에 100마이크로리터의 혼성화 용액을 추가합니다. 튜브의 가장자리를 밀봉하기 위해 투명 필름을 바르십시오. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호하고 샘플을 섭씨 37도의 수조에서 최소 24시간 동안 배양합니다.

혼성화 용액을 흡입하지 않고 샘플에 1ml의 세척 버퍼를 추가합니다. 샘플을 섭씨 37도의 수조에서 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다. 세척 버퍼가 흡입되면 샘플에 1ml의 신선한 세척 버퍼를 추가하고 다시 배양합니다.

배양이 끝나면 세척 버퍼를 흡입하고 샘플에 50마이크로리터의 장착 매체를 추가합니다. 해부 실체현미경 아래에서 피펫을 사용하여 샘플을 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 겸자를 사용하여 현미경 슬라이드의 고환을 일렬로 배열하여 이미징 중 샘플 식별을 용이하게 합니다.

커버 슬립으로 샘플을 덮고 티슈로 커버 슬립의 가장자리를 닦아내어 과도한 장착 매체를 제거합니다. 커버 슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 매니큐어가 마를 수 있도록 실온에서 10분 동안 어두운 곳에 두십시오. rRNA 신호는 핵소체에서 검출되었으며, 핵 내, 특히 큰 핵과 핵체를 가진 생식 세포에서 DAPI 공극 영역으로 나타났습니다.

rRNA loci가 결핍된 샘플의 세포질에서 희미하고 비특이적인 신호가 관찰되었습니다. 대부분의 세포에서 YrRNA 신호는 독점적으로 검출되었으며, 이는 YrDNA 자리에서 rRNA 전사를 나타냅니다. X와 YrRNA의 동시 발현은 생식 세포에서 관찰되었으며, 신호는 단일 핵으로 병합되거나 두 개의 핵으로 분리되었습니다.