Name: Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH: Drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster에서 SNP-FISH를 이용한 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출 방법을. 형광 현미경으로 rRNA 신호를 관찰하여 세포가 rDNA 유전자좌를 선택적으로 전사하는 메커니즘을 규명합니다.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>PTC Tempo 96 Thermal Cycler</td><td>Bio Rad</td><td>12015382</td><td>모든 thermal cycler를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>0.2 mL 8 strip flatcap PCR tubes</td><td>VWR</td><td>89133-912</td><td>모든 호환 가능한 튜브 사용 가능</td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td>sequencing PCR 앰플리콘 크기를 확인할 때 사용</td></tr><tr><td>1.5 mL 눈금 마이크로 원심분리기</td><td>튜브 USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>인증된 RNase free 튜브는</td></tr><tr><td>2mM dNTP Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0241</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>1610743</td><td>겔 전기영동에 사용됩니다. 모든 TAE 버퍼를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td></td><td></td><td>모든 NaCl은 어떤 출처에서든 사용하거나 준비할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>97064-250</td><td>모든 Agarose를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>ApE - A 플라스미드 편집기 소프트웨어</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ <tr><td>투명 매니큐어</td><td></td><td></td><td>모든 소매점의 모든 매니큐어를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>커버 유리, No. 1 두께</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A38</td><td></td></tr><tr><td>탈이온화 포름아미드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>NC9569627</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 설페이트 나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>D8906-10G</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR 마스터 믹스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11252-20</td><td>샘플 해부에 사용</td></tr><tr><td>EDTA(0.5M), Ph 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1021</td><td>이와 유사한 모든 제품을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>모든 200 프루프 에탄올을 사용할 수 있습니다. Rnase가 없는 조건의 투과화 및 세척을 위해 70% 에탄올로 희석하는 데 사용</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>수평 미니 겔 전기영동 시스템</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-170</td><td>모든 겔 전기영동 시스템 사용 가능</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Test Staining Dish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71564</td><td>시료 해부에 사용</td></tr><tr><td>너트 쉐이커</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BMSB3D1020</td><td>모든 너트 쉐이커를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>USA Scientific</td><td>3023-4526</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(10X) pH 7.4, RNase-free</td><td>Life Technologies</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>피어싱 16% 포름알데히드(w/v), 메탄올 프리</td><td>Life Technologies</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Precision General Purpose Water Bath</td><td>Life Technologies</td><td>TSGP02</td><td>모든 수조를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>모든 Gel 추출 키트를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>재조합 단백질분해효소 K 용액 (20 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2546</td><td>유사한 제품을 모두 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Rnase-free UltraPure BSA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae tRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8759</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X), RNase-free</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Life Technologies</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td>유사한 제품을 사용할</td></tr> <tr><td>수 있습니다.UltraPure DNase/RNase-Free 증류수</td><td>Life Technologies</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>바나딜 리보뉴클레오시드 복합체</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 마운팅 미디어(DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VWR Superfrost 현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48311-601</td><td></td></tr><tr><td>y[1]w[1] Drosophila melanogaster line</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>1495</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss 현미경 Zeiss 현미경</td><td></td> 호환 <td>가능한 방출 및 검출 기능이 있는 모든 컨포칼 현미경을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000-C 스테레오 현미경 및 광원</td><td>현미경 중앙</td><td>455053</td><td>모든 입체 현미경을 사용할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

single nucleotide polymorphism-sensitive fish: drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 rna 전사 검출

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

SNP 유전형 분석의 염기서열분석 결과는 X rDNA 자리와 Y rDNA 자리 사이의 SNP 차이를 검출할 것으로 예상됩니다. 이러한 SNP는 염기서열분석 크로마토그램에서 SNP 위치를 직접 평가하여 검출됩니다 (그림 2). 여성 샘플의 염기서열분석은 SNP 위치에서 단일 염기서열분석 신호를 가질 것으로 예상되며, 이는 두 X 염색체 사이의 SNP 동형접합성을 나타냅니다 (그림 2A). 수컷 샘플 염기서열분석 결과는 SNP 위치에서 이중 피크를 가질 것으로 예상됩니다 (그림 2B). 여성 샘플 염기서열분석에서 결정된 X 염색체 유전자형을 기반으로 non-X 변이체는 Y 염색체 rDNA SNP( 즉, 그림 2의 18S SNP 염기서열분석의 경우 X = T, Y = C)로 추론됩니다. 또는, 수컷 샘플의 SNP 위치에서 단일 염기서열분석 피크는 해당 SNP 위치에서 수컷과 암컷 rDNA 유전자좌 사이의 동형접합성을 나타내며, 해당 위치는 rRNA SNP-FISH에 사용할 수 없습니다.
SNP FISH에 대한 프로토콜에 따라 슬라이드에 장착하여 샘플을 시각화하고 밀봉된 커버 슬립 아래에 놓은 다음 컨포칼 현미경을 볼 수 있습니다. 표 3에 나열된 프로브를 사용하여 Y 유래 rRNA 신호는 Alexa Fluor 647 방출에 의해 검출되고 X 유래 rRNA 신호는 Alexa Fluor 488 방출에 의해 검출됩니다. rRNA 신호는 핵소체에서 관찰될 것으로 예상되며, 이는 핵의 DAPI가 부족한 구멍으로 식별될 수 있습니다(그림 3A). nucleolus는 큰 핵과 nucleolus로 인해 생식 세포에서 특히 쉽게 식별할 수 있습니다(그림 3A). 희미한 신호는 일반적으로 세포질에서도 발견될 수 있지만(그림 3), 이는 상보적 SNP를 포함하는 rRNA가 없는 샘플에서도 검출될 수 있는 비특이적 신호입니다(즉, Y rDNA가 없는 세포의 Y 신호 또는 X rDNA가 없는 세포의 X 신호; 그림 3B-C). 또한, X 또는 Y rDNA 유전자좌가 없는 샘플에서도 X 및 Y rRNA의 인위적인 공동 표지는 때때로 체세포 허브에서 검출될 수 있습니다(그림 3B-C, 노란색 화살표). 따라서 유전자좌 특이적 전사를 평가하기 위해 핵 신호만 사용해야 합니다. 대부분의 세포, 특히 체세포는 Y rRNA 신호만 가질 것으로 예상되며, 이는 rRNA가 Y rDNA 자리(그림 3A, 노란색 점선 및 빨간색 화살표)에서 독점적으로 전사됨을 나타냅니다10,17. 그러나 X 및 Y rRNA의 동시 발현은 종종 생식 세포, 특히 생식 세포 줄기 세포에서 검출됩니다13 (그림 3A, 흰색 점선 원). 공동 발현 세포의 X 및 Y rRNA 신호는 인접하여 단일 핵소체를 형성하거나(그림 3A 상단 세포) 분리되어 두 개의 핵소탈(그림 3A 하단 세포)을 형성할 수 있습니다. 그림 3의 예는 2개의 SNP(2개의 ITS1 SNP)만을 대상으로 하는 프로브 세트를 사용하는 rDNA SNP-FISH에서 제공되었으며, 이는 rDNA SNP-FISH에 2개의 SNP만 필요함을 보여줍니다. 그러나, 4개의 SNP들(13) 모두를 표적으로 하는 프로브를 사용할 때 더 강력한 신호가 관찰된다.
음성 대조군은 특히 분석법을 처음 문제 해결할 때 프로브가 잘못된 SNP 표적과 교차 반응하지 않는지 확인하기 위해 이 분석에 포함된 중요한 요소입니다. X 염색체 음성 대조군에는 X 염색체 rDNA가 결핍된 모든 상태(예: rDNA 결실이 있는 X 염색체를 가진 남성)가 포함됩니다. X 염색체 음성 대조군은 Y rRNA 신호만 검출하고 X rRNA는 검출하지 않을 것으로 예상됩니다 (그림 3B). Y 염색체 음성 대조군에는 Y 염색체 rDNA가 결핍된 모든 상태가 포함됩니다. 이러한 질환의 몇 가지 예로는 XX 여성 조직, Y 염색체가 없는 남성 조직 또는 rDNA 결실15를 가진 Y 염색체를 가진 남성 조직 등이 있습니다. Y 염색체 음성 대조군은 X rRNA 신호만 검출하고 검출 가능한 Y rRNA 신호는 없을 것으로 예상됩니다 (그림 3C). 이러한 제어는 프로브 특이성을 결정하는 데만 중요한 것이 아니라 신호 배경 또는 아티팩트를 결정하는 데에도 중요합니다. 이러한 대조군에서 특이성을 제공하는 모든 새로운 프로브 또는 분석 조건을 사용하여 유전자좌 특이적 rDNA 전사를 정확하게 검출할 수 있습니다.
다양한 유전적, 발달적 또는 환경적 조건에 따라 rDNA가 Y염색체 rDNA 유전자 좌위13,17에서 독점적으로 전사될 가능성이 변경될 수 있습니다. 단일 유전자 자리 또는 여러 유전자 자리에서 rDNA 전사 빈도를 정량화하고 샘플 간에 직접 비교할 수 있습니다. rDNA 유전자좌 전사의 차이를 정량적으로 비교하기 위해서는 각 세포를 Y-우성, 공동 우성 또는 X-우성으로 개별적으로 분류해야 합니다. 셀은 해당 신호만 감지되는 경우에만 Y- 및 X-우성으로 분류됩니다. Y 및 X rRNA 신호를 모두 가진 모든 세포는 한 신호가 다른 신호보다 훨씬 약하더라도 공동 우성으로 간주됩니다. 따라서, 매우 강한 X 및 Y 신호를 포함하는 셀은 Y가 강하고 X가 약하거나 X가 강하고 Y 신호가 약한 셀과 질적으로 동일한 것으로 간주됩니다. 각 범주의 모든 샘플에 대한 모든 세포의 총 백분율은 카이 제곱 테스트를 통해 샘플 간에 비교할 수 있습니다. 이 분석은 특정 rDNA 유전자 자리가 전사되었는지 여부를 정성적으로 결정하는 데 효과적이지만, 개별 SNP-FISH 신호의 형광 강도를 직접 정량화할 때 샘플 간의 일관된 평가는 관찰되지 않았습니다. 따라서 샘플 간 FISH 신호 강도 또는 단일 세포 내 X 및 Y rDNA 신호의 상대적 강도에 대한 정량적 평가를 수행하지 않는 것이 좋습니다. 형광 강도의 이러한 불일치의 원인은 불분명하지만, 모든 타겟 rRNA에 결합하지 않는 마스킹된 프로브의 비효율적인 결합 때문일 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig01.jpg"> 
그림 1: SNP-FISH 방법의 다이어그램. (A) 전통적인 FISH 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브는 단 하나의 뉴클레오티드만 다른 비표적 RNA와 교차 반응합니다. (B) SNP-FISH 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브의 3' 영역에 결합된 상보적 마스크 올리고뉴클레오티드를 사용합니다. 마스크는 표적 염기서열에 결합할 수 있는 뉴클레오티드가 10개에 불과합니다. 마스킹되지 않은 프로브 영역은 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 다른 비표적 염기서열에 안정적으로 결합하지 않습니다. 프로브가 표적에 결합한 후 마스크가 프로브에서 분리되어 프로브와 표적 사이에 안정적인 결합이 가능합니다. (C) 공통 마스크와 결합된 서로 다르게 표지된 쌍을 이룬 SNP 프로브는 교차 반응 없이 단일 뉴클레오티드에 의해 다른 표적에 특이적으로 결합합니다. (D) 여러 프로브를 함께 모아 뚜렷한 rRNA 하플로타입을 특이적으로 라벨링할 수 있습니다. y1w1 Drosophila melanogaster 균주에서 X와 Y rDNA 유전자좌 사이에 4개의 SNP 차이가 특성화되었습니다. 18S rRNA에 1개의 SNP, 28S rRNA에 1개, pre-rRNA의 ITS1 부분에 2개의 SNP가 있습니다. SNP-FISH에 사용되는 X 및 Y 특이적 rRNA 하플로타입이 표시됩니다. 4개의 rRNA SNP에서 X rDNA 변이체를 표적으로 하는 프로브는 일반적인 형광단(녹색)에 접합되고, Y rDNA 변이체를 표적으로 하는 프로브는 다른 형광단(자홍색)에 접합됩니다. 각 SNP(총 4개)에 대해 공통 마스크가 사용됩니다. rRNA의 각 SNP 위치에서 결합하는 SNP 특이적 probe는 최대 4개의 FISH 올리고뉴클레오티드 probe를 사용하여 X 및 Y rDNA loci의 rRNA를 특이적으로 라벨링할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig02.jpg"> 
그림 2: 동형접합 및 이형접합 rDNA SNP 염기서열분석 결과의 예. 18S SNP의 크로마토그램 염기서열분석 예시: (A) 여성 및 (B) 남성 샘플의 DNA 염기서열분석. 18S SNP 위치는 별표(*)로 표시됩니다. 여성 샘플의 SNP 위치에 대한 단일 티민(T) 신호는 X 염색체 rDNA 자리의 SNP 위치에 있는 티민을 나타냅니다. 남성 샘플에서 티민과 시토신(C)으로 분할된 SNP 위치의 이중 신호는 Y 염색체 rDNA 자리의 SNP 위치에 있는 시토신을 나타냅니다(티민이 X 염색체 자리에 있다는 것을 알고 추론). 염기서열분석 결과는 플라스미드 편집기 소프트웨어인 ApE를 사용하여 관찰하였다19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig03.jpg"> 
그림 3: SNP-FISH의 예는 두 개의 SNP-FISH 프로브 세트만 사용하는 초파리 고환의 결과입니다. (A) X 및 Y rDNA를 모두 가진 동물의 고환에서 SNP FISH의 예, (B) Y rDNA만 또는 (C) X rDNA만 있는 동물의 고환에 있는 예. 이 예시에서는 두 개의 ITS1 rRNA SNP를 라벨링하는 프로브 세트만 사용했으며, 이는 rRNA SNP FISH가 두 개의 표적 SNP에서만 작동한다는 것을 보여줍니다. 생식 세포는 큰 둥근 핵으로, 체세포는 더 작고 덜 둥근 핵으로 식별됩니다. 생식계열 줄기세포는 별표(*)로 표시된 체세포 허브 바로 옆의 위치로 식별됩니다. X 및 Y rDNA 유전자좌 모두에서 rDNA를 전사하는 생식 세포는 X 및 Y 핵 FISH 신호(흰색 점선 원, A-A'')에 의해 식별됩니다. Y rDNA 유전자 좌위에서만 DNA를 전사하는 생식 세포는 Y 핵 FISH 신호(노란색 점선)만 가지고 있습니다. Y만 발현하는 체세포는 빨간색 화살표로 표시됩니다. X 및 Y rDNA 유전자 자리의 인위적인 공동 표지는 체세포 허브(노란색 화살표)에서 관찰할 수 있습니다. 눈금 막대는 10μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: X 염색체 자리의 rRNA 서열. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/Dm_45S_rRNA.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH: Drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

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높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

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Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila (초파리의 단일 분자 스케일에서 근육 전사 역학 연구)

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Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

배우세요 Drosophila melanogaster에서 SNP-FISH를 이용한 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출 방법을. 형광 현미경으로 rRNA 신호를 관찰하여 세포가 rDNA 유전자좌를 선택적으로 전사하는 메커니즘을 규명합니다.

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH: Drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출

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