행동 관찰을 위한 제브라피시 유충에 대한 휘발성 마취제 투여

본 연구는 마취 약리학에 중점을 두고 있으며, 여기에는 마취 메커니즘과 마취 부작용의 메커니즘에 대한 관심이 포함됩니다. 마취 약리학을 연구하기 위한 행동 모델로 유충 제브라피시를 사용하는 것은 빠르게 확대되고 있으며 대규모 스크리닝 실험에 사용하기에 적합한 등 많은 이점이 있습니다. 휘발성 마취제와 정맥 주사 마취제의 비교는 여전히 어려운 과제인데, 그 이유는 비수생 동물에게 휘발성 마취제를 투여하는 것이 정맥 마취제보다 훨씬 쉽기 때문이다.

반대로, 정맥 마취제는 휘발성 마취제보다 수생 동물에게 더 쉽게 투여됩니다. 이 프로토콜은 유충 제브라피쉬에서 행동 실험을 수행하기 위해 밀폐된 챔버에서 휘발성 마취제를 투여하는 비교적 저렴하고 접근하기 쉬운 수단을 제공합니다. 이러한 성격의 다른 프로토콜은 종종 비용이 많이 들거나 이러한 유형의 장비를 만들거나 획득할 수단이 없는 사람들이 쉽게 접근할 수 없는 일종의 맞춤형 장치를 필요로 합니다.

시작하려면 깨끗하고 평평한 표면에 0.5mm 실리콘 시트를 놓습니다. 시트에 주름이 있는지 검사하고 가능하면 피하십시오. 70% 알코올로 시트를 청소하여 기름이나 부스러기를 제거하십시오.

시트가 완전히 건조되면 페인트 브러시와 같은 어플리케이터를 사용하여 접착 프라이머를 실리콘 시트에 얇고 균일하게 코팅합니다. 접착 프라이머가 도포되면 양면 코팅 테이프를 종이 뒷면이 위를 향하도록 실리콘 시트에 맞춥니다. 롤러를 사용하여 실리콘에 테이프를 점차적으로 적용하여 표면을 매끄럽게 하고 기포를 제거합니다.

필요에 따라 프라이머를 작은 부분으로 다시 바르고 프라이머가 1-5초 안에 건조될 때까지 테이프 적용을 계속합니다. 실리콘 시트를 뒤집어 실리콘 면이 위로 향하게 하여 기포를 시각화하고 제거하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음 접착 실리콘을 최소 10mm 너비의 스트립으로 자릅니다.

스트립이 웰 플레이트의 한 줄 너비를 덮을 수 있을 만큼 충분히 긴지 확인하십시오. 휘발성 마취제를 준비하려면 HPLC 또는 섬광 바이알에 비휘발성 용매를 일정 량의 첨가하여 휘발성 마취제의 최종 희석액이 추가되면 헤드 스페이스를 최소화합니다. Hamilton 가스 밀폐 주사기를 사용하여 휘발성 마취제를 첨가하고 바이알을 빠르게 밀봉합니다.

필요에 따라 볼텍싱 또는 초음파 처리로 바이알을 혼합합니다. 제브라피시 접시를 준비하는 동안 임시로 보관하십시오. 행동 실험을 설정하려면 수정 후 5일이 지나면 유충 제브라피시 한 마리를 유리 96 웰 플레이트의 다른 모든 줄로 옮깁니다.

각 웰에서 E-three 용액을 조심스럽게 제거합니다. 전사 피펫을 사용하여 행의 각 웰을 실험 용액으로 채웁니다. 접착 실리콘 스트립을 사용하여 스트립을 빠르게 아래쪽으로 눌러 거품이 형성되고 물고기가 인접한 우물로 넘쳐 흐르는 것을 방지합니다.

그런 다음 접시 상단을 단단히 눌러 각 웰이 밀봉되었는지 확인합니다. 용액이 교환되고 플레이트의 다른 모든 행에 있는 모든 웰이 밀봉될 때까지 밀봉 과정을 반복합니다. 접시를 부드럽게 뒤집어 기포가 있는지 검사합니다.

실리콘 접착면이 아래를 향하게 하여 플레이트를 행동 관찰 장치에 놓고 행동 실험을 수행합니다. 밀폐된 웰에서 세보플루란의 농도는 3시간 동안 최소한의 손실을 보였고, 이소플루란의 농도는 4% 감소를 보였다. 두 마취제 모두 처음 30분에서 60분 동안 큰 손실을 보이지 않았다.

세보플루란의 평균 유효 농도는 자발적 운동의 경우 62 마이크로몰, 유도 운동의 경우 126 마이크로몰이었으며, 사다리는 이전에 보고된 240 마이크로몰보다 현저히 낮았으며, 이는 이 방법으로 기밀 밀봉을 생성하는 것이 개선되었기 때문일 수 있습니다. 열린 우물과 밀폐된 우물 사이에서 자발적인 움직임의 상당한 차이가 관찰되었으며, 이는 우물의 산소 고갈로 인한 것으로 보이며 이는 이 기술의 중요한 한계입니다.