2025년 5월 16일
구리 나노 입자는 반응성 산소 종을 생성하여 항균제로 작용합니다. 여기에서는 구리 나노 입자가 임상적으로 관련된 세 가지 병원체에 효과적이며 프로그래밍된 특정 세포 사멸 경로가 이 살균 과정에 관여한다는 것을 입증하는 절차가 제시됩니다.
이 연구는 세 가지 일반적인 임상적으로 중요한 박테리아에 대한 구리 나노 입자 살균 효능을 조사합니다. ROS 생성 및 잠재적인 프로그램된 세포 사멸 관여를 포함한 사례를 탐구합니다.
현재 과제 중 하나는 일관된 콜로니 수를 달성하는 것입니다. 나는 이것이 개입에서 비롯된다고 믿습니다. 희석 중 세포 현대화는 경험이 풍부한 계수에 비해 위치에 따라 가짜 계수에 줄여집니다.
우리 그룹은 구리 나노입자 살균 메커니즘을 연구하기 위해 세포 조절제를 사용한 최초의 그룹으로, 박테리아 사멸이 ROS 생성 및 자가포식과 같은 세포 과정과 관련이 있음을 밝혔습니다.
이 프로토콜은 구리 나노입자가 박테리아를 죽이는 메커니즘에 대한 더 깊은 이해의 필요성을 다루며, 특히 박테리아 프로그램된 세포 사멸 경로의 미개척 영역에 초점을 맞춥니다.
다양한 세포 조절제를 사용하여 구리 나노입자 유도 박테리아 사멸이 자가포식 및 ROS 과부하와 관련되어 있음을 확인하고 간단한 설계를 통해 신뢰할 수 있는 삼중 기반 실험으로 지원되는 주요 경로를 확인했습니다
[해설자] 시작하려면 상업용 공급업체로부터 직경 25나노미터 및 60-80나노미터의 상업용 구리 나노분말을 얻으십시오. 각 나노입자 크기에 대한 분산제로 1밀리몰 SDS 1밀리리터를 사용합니다. 그런 다음 실온에서 최소 30분 동안 초음파 수조를 사용하여 나노 입자를 분산시킵니다. 다음으로, 각각의 생물학적 자원 센터에서 대장균, Acinetobacter baumannii 및 황색포도상구균 균주를 얻습니다. 섭씨 37도의 호기성 조건에서 LB 국물 10밀리리터에 각 박테리아를 배양합니다. LB 배지에서 박테리아 배양액을 희석하여 600나노미터에서 약 0.5의 광학 밀도에 도달합니다. 이제 스톡 구리 나노입자 용액을 사용하여 두 크기의 밀리리터당 0에서 100마이크로그램 사이의 농도 범위를 준비합니다. 500마이크로리터의 박테리아 배양물을 미세 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 실온에서 10분 동안 3,300G에서 원심분리합니다. 상층액을 피펫팅한 후 각 튜브에 두 가지 크기의 나노입자를 서로 다른 농도로 추가합니다. 대조군을 음성 대조군으로 500마이크로리터의 PBS로, 양성 대조군으로 500마이크로리터의 70% 알코올로 처리합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 분당 200회전으로 24시간 동안 흔들면서 모든 샘플을 배양합니다. 배양 후 박테리아를 PBS로 세척하고 LB 한천 플레이트에 펴 바릅니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날 모든 치료 그룹에 대해 각 플레이트의 콜로니를 계산합니다. 박테리아를 5마이크로몰 SBI로 2시간, 0.5마이크로몰 네크로술폰아미드를 1시간 동안 처리하고, 100나몰 워트마닌을 30분 동안 또는 100나노몰 Z-VAD로 30분 동안 처리합니다. 모든 전처리가 완료된 후 모든 튜브를 3,300G에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 800마이크로리터의 PBS에 재현탁하여 전처리 조절제를 세척합니다. 재현탁된 펠릿을 분배합니다. 각 튜브를 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 교반과 함께 배양하기 전에 나노입자 조절제 혼합물에 펠릿을 재현탁합니다. 이제 70% 에탄올과 PBS를 양성 및 음성 대조군으로 추가합니다. 억제제로 처리된 빈 대조군을 포함하되 나노입자는 포함하지 않습니다. 배양 후, 세포 생존율 시약을 1:10 부피 비율로 피펫팅하고 배양합니다. 배양액을 다시 원심분리한 후, 상청액을 96웰 플레이트로 옮깁니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 560나노미터 여기 및 590나노미터 방출에서 형광을 측정합니다. 남은 상청액을 음수 5의 10승과 음수 4의 10승으로 희석하고 LB 한천 플레이트에 퍼뜨려 배양합니다. 다음날 단일 식민지를 세십시오. 박테리아 배양물을 미세 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 배양물을 405나노미터 자외선에 3시간 동안 노출시킵니다. 다음으로, 배양액을 섭씨 45도에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 박테리아를 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다. 저온 처리 후 박테리아를 3% 과산화수소에 30분 동안 배양합니다. 대조군을 LB 국물에 섭씨 37도로 유지합니다. 이제 밀리리터당 1-100마이크로그램 사이의 농도의 20 또는 60나노미터 입자로 박테리아를 24시간 동안 처리합니다. 그런 다음 처리된 박테리아를 PBS로 두 번 세척합니다. 원심분리 후, 박테리아 펠릿을 2',7' 디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트 염료의 5마이크로몰 용액에 재현탁합니다. 520 또는 530 나노미터 방출에서 형광 강도를 분석합니다. 대장균의 콜로니 수는 밀리리터당 1마이크로그램에서 20나노미터 구리 나노입자, 밀리리터당 5마이크로그램에서 60나노미터 구리 나노입자만큼 크게 감소했습니다. 황색포도상구균은 두 나노입자 크기의 모든 농도에서 콜로니 수가 크게 감소한 것으로 나타났습니다. Acinetobacter baumannii에서 콜로니 수를 줄이려면 20나노미터 구리 나노입자의 밀리리터당 5마이크로그램과 60나노미터 구리 나노입자의 밀리리터당 10마이크로그램이 필요했습니다. 구리 나노입자 처리는 모든 박테리아에서 활성산소종 생성을 유도했으며, 20나노미터 입자는 더 낮은 농도에서 양성 세포의 가장 높은 비율을 나타냈습니다. 대조적으로, 60나노미터 구리 나노입자 처리는 모든 농도에서 일관된 활성 산소종 생성으로 이어졌습니다. 프로그래밍된 세포 사멸 조절제 Z-VAD는 저농도에서 중간 농도의 두 나노입자 크기로 처리된 대장균의 생존율을 증가시켰습니다. NSA 치료는 20나노미터 구리 나노입자 농도의 모든 수준에서 황색포도상구균의 생존율을 향상시켰습니다. Acinetobacter baumannii는 20 및 60나노미터 구리 입자 노출 시 밀리리터당 1, 5, 10마이크로그램 미만에서 Z-VAD로 향상된 생존력을 나타낸 반면, NSA는 20나노미터 구리 나노입자 노출 시 밀리리터당 10마이크로그램만으로 생존율을 증가시켰습니다.
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이 연구는 세 가지 임상적으로 중요한 박테리아에 대한 구리 나노입자의 살균 효과를 조사합니다. 이 연구는 반응성 산소 종(ROS)의 생성과 이 과정에서 프로그래밍된 세포 사멸 경로의 관여를 탐구합니다.
Addressing multidrug-resistant pathogens requires novel bactericidal strategies with mechanistic clarity and predictive value. This study positions copper nanoparticles as a tool for interrogating bacterial programmed cell death and reactive oxygen species pathways, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in anti-infective discovery. The methodology enables robust evaluation of nanoparticle efficacy and resistance potential, informing portfolio decisions in antimicrobial R&D.
This methodology integrates into the discovery-to-preclinical continuum for anti-infective R&D, enabling mechanistic de-risking and quantitative assessment of nanoparticle interventions.