Human CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool을 사용한 신장 대식세포의 급격한 고갈

우리는 케모카인 구동 단핵구 회수 및 손상 후 면역 감시의 틈새 구축에 초점을 맞춰 신장 마이크로파지 재생을 연구하기 위해 마우스에서 인간 CD59 발현 세포의 중간신 매개 봉제를 사용합니다. 우리 분야의 최근 개발은 신장 대식세포 재생의 메커니즘을 밝히고 대식세포를 모집하는 특정 케모카인과 급성 신장 손상 후 면역 감시가 어떻게 재확립되는지 강조합니다. 우리는 타목시펜 유도 극저온 유전학, 중간ly신 절제, 다중 매개변수 유세포 분석 및 생체 내 현미경을 결합하여 신장 대식세포를 실시간으로 절제, 추적 및 시각화합니다.

주요 과제는 전신 염증을 피하고, 상주 대식세포만을 표적으로 삼고, 섬세한 신장 mIcroenvironment를 방해하지 않고 빠른 재생을 측정하는 것입니다. 우리는 단핵구가 절제 후 7일 이내에 신장 대식세포의 88%를 회복시키는 것으로 나타났으며, 이는 CX3 CR1, CX3 CL1 신호 전달 축에 결정적으로 의존하는 과정입니다. 시작하려면 옥수수 기름을 섭씨 42도로 예열하십시오.

예열된 옥수수 기름 5밀리리터에 타목시펜 100mg을 녹여 밀리리터당 20mg 농도의 원액을 준비합니다. 타목시펜을 10-12주 령령의 수컷 마우스에게 체중 그램당 100마이크로그램의 용량으로 복강 내 투여합니다. 15일 후, 체중 그램당 120나노그램의 용량으로 중간용신을 마우스에 단일 정맥 주사합니다.

중간식신 투여 후 1일, 3일 및 7일에 유세포 분석을 수행하여 상주 대식세포 절제 및 후속 재생을 모니터링하고 확인합니다. 신장 채취를 위해 가는 집게와 가위를 사용하여 안락사된 마우스의 하복부 부위를 수평으로 절개합니다. 절개 부위를 정중선을 따라 흉곽이나 흉골 바로 아래까지 수직으로 확장합니다.

피부와 근육을 부드럽게 집어넣어 흉강을 드러냅니다. 혈액이 순환계에서 배출되도록 우심방을 자릅니다. 21-23게이지 바늘을 좌심실에 삽입합니다.

혈액을 씻어내기 위해 10-20밀리리터의 차가운 PBS로 관류를 시작합니다. 신장이 창백해 보일 때까지 관류를 계속하여 효과적인 혈액 제거를 나타냅니다. 신장을 등쪽 체벽에 대고 집게와 가위를 사용하여 주변 조직에서 부드럽게 분리합니다.

신장 캡슐을 절제하고 즉시 신장을 차가운 PBS에 넣어 분해를 방지합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS, 콜라게나제 IV 및 DNase I을 혼합하여 소화 효소 칵테일 100ml를 준비합니다. 효소 용액을 신선하게 준비하고 사용할 때까지 얼음 위에 보관합니다. 멸균 가위를 사용하여 5밀리리터의 HBSS가 들어 있는 페트리 접시에서 신장을 작은 조각으로 다집니다.

다진 신장 조직을 준비된 효소 용액 10밀리리터가 들어 있는 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 이제 튜브를 섭씨 37도에서 30분 동안 부드럽게 교반하면서 배양하여 조직을 해리시킵니다. 피펫이나 주사기 플런저를 사용하여 조직을 부드럽게 분쇄하여 세포 덩어리를 더 분해합니다.

세포 현탁액을 40마이크로미터 세포 여과기를 통과시켜 파편을 제거합니다. 세포 현탁액을 섭씨 18도에서 10분 동안 700G에서 원심분리합니다. 다음으로 버퍼를 조심스럽게 디캔팅합니다.

적혈구를 용해하기 위해 실온에서 5분 동안 배양하기 전에 펠릿을 용해 완충액 5밀리리터에 재현탁합니다. PBS를 첨가하여 세포를 세척하고 용해 완충액을 제거합니다. 생성된 단일 세포 현탁액을 추가 사용할 때까지 얼음 위에 유지하십시오.

밀도 구배 원심분리의 경우 먼저 세포 펠릿을 10밀리리터의 30% 밀도 구배 용액에 재현탁합니다. 이것을 원심분리기 튜브에 3밀리리터의 70% 밀도 구배 용액에 조심스럽게 겹겹이 쌓습니다. 휴식 없이 500G에서 30분 동안 구배를 원심분리합니다.

원심분리 후 30%와 70% 용액 사이의 계면층을 조심스럽게 수집합니다. 수집된 세포를 10밀리리터의 PBS로 두 번 세척하고 각 세척액을 500G에서 10분 동안 원심분리합니다. 최종 세포 펠릿을 1.5밀리리터 튜브에 있는 1밀리리터의 FACS 완충액에 재현탁합니다.

명시야 현미경에서 혈구계를 사용하여 세포를 계산하고 세포 농도를 밀리리터당 6개의 세포의 거듭제곱으로 10의 2배로 조정합니다. 650G에서 5분 동안 원심분리하여 1.5밀리리터 튜브에 세포를 펠릿화하고 세포 펠릿을 1밀리리터의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 항 CD 16 또는 32 항체를 1 내지 200 희석으로 첨가하여 비특이적 FC 수용체 결합을 차단합니다.

세포를 섭씨 4도에서 15분 동안 배양한 후, 아쿠아 라이브/데드 염료 및 CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE 및 F4/80 BV 605를 포함한 사전 접합 항체 칵테일로 세포를 염색합니다. 항체 칵테일을 세포 현탁액에 직접 첨가합니다. 형광단을 보호하기 위해 샘플을 암울한 곳에서 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 FACS 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다. 세포를 1% 파라포름알데히드에 얼음 위에서 30분 동안 고정시킵니다. 그런 다음 잔류 고정액을 제거하기 위해 FACS 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다.

유세포 분석기를 사용하여 염색 및 고정된 세포를 획득합니다. 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 마커 CD45, CD11B 및 F4/80을 사용하여 신장 및 기타 조직 상주 대식세포 및 미세아교세포를 식별합니다.

초기 게이팅을 수행하여 전방 및 측면 산란 프로파일을 사용하여 살아있는 세포를 선택합니다. 전방 산란 영역과 높이 게이팅을 사용하여 이중선을 제거합니다. 생존 염료를 사용하여 죽은 세포를 배제합니다.

CD45 양성 집단에 대한 게이팅을 통해 면역 세포를 풍부하게 합니다. 게이팅 전략에 표시된 대로 신장 상주 대식세포를 CD45 양성 게이트 내의 CD11b+F4/80hi 세포로 정의합니다. 미세아교세포 집단을 CD11b+CD45 중간 세포로 정의하고 최종 분석을 수행합니다.

SDS 페이지 겔에서 54킬로달톤 근처에서 단일 두드러진 단백질 밴드가 관찰되어 재조합 중간리신의 순도와 예상 분자량이 확인되었습니다. 정제된 중간용신은 용량 의존적 방식으로 강력한 용혈 활성을 나타내어 밀리리터당 7.24나노그램에서 50% 적혈구 용해를 달성하고 밀리리터당 650나노그램에서 거의 완전한 용해를 달성했습니다. 유세포 분석 분석은 중간용신 투여 1일 후 유도성 인간 CD59 화합물 cre-R 마우스에서 신장 대식세포의 성공적이고 선택적인 고갈을 확인했으며 대조군 마우스에서는 고갈되지 않았습니다.

신장 대식세포는 3일째에 다시 증식하기 시작했고 7일째에는 원래 인구의 약 88%로 회복되었습니다. 새로 재생된 신장 대식세포의 5%만이 7일째까지 인간 CD59를 발현했으며, 이는 재증식이 주로 제자리 증식보다는 단핵구 모집을 통해 발생했음을 나타냅니다.