유세포분석을 사용하여 손상된 척수에서 미세아교세포(microglia) 및 말초 침투 대식세포(peripheral infiltrating macrophages in the injured spinal cords) 확인

우리의 연구는 척수 손상에서 미세아교세포와 침윤 대식세포를 식별하여 최적화된 유세포 분석을 사용하여 신경 염증에서의 역할을 명확히 합니다. 유세포 분석 및 밀도 구배 원심분리는 높은 특이성과 효율성으로 중추신경계 면역 세포를 분리하고 표현형을 분석하는 데 핵심입니다. 형태학적으로 유사한 미세아교세포와 대식세포를 구별하고, 분리 중 세포 손실을 최소화하고, 동적 손상 미세환경에서 열등한 미세특이성은 여전히 주요 장애물로 남아 있습니다. 기존 방법은 침윤 대식세포에서 상주 미세아교세포를 안정적으로 분리하지 못합니다. 우리의 마커 기반 접근 방식은 척수 손상 연구에서 이러한 중요한 한계를 해결합니다.

[발표자] 시작하려면 호환되는 소프트웨어와 함께 유세포 분석기를 사용하여 이소타입 제어 튜브를 분석합니다. 전방 산란 및 측면 산란 전압을 조정하여 세포 집단을 적절한 범위 내에 배치합니다. X축에 IgG APC가 있고 Y축에 IgG PE가 있는 그래프, X축에 IgG-FITC가 있는 그래프, Y축에 IgG APC-Cy7이 있는 두 개의 추가 그래프를 설정합니다. 그런 다음 IgG APC, IgG PE, IgG FITC 및 IgG APC-Cy7에 대한 형광 채널 전압을 조정하여 이중 음성 영역의 10의 3제곱 내에 세포 집단을 배치합니다. 이소형 제어 튜브를 사용하여 최적화된 전압을 확인한 후 모든 설정을 유지합니다. 항체 염색된 실험 튜브 분석을 진행합니다. X축에 CD11b PE가 있고 Y축에 측면 산란이 있는 그래프를 설정합니다. CD68 FITC 및 CCR7 APC-Cy7로 다른 그래프를 설정합니다. 이소형 대조군을 참조로 사용하여 CD11b 양성 영역을 묘사하고 이를 P1 게이트로 정의합니다. CD68 FITC 및 CCR7 APC-Cy7 그래프를 선택합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 모집단 표시를 열고 F4 열을 P1에 할당합니다. 데이터를 수집한 후 필요에 따라 형광 보정을 조정합니다. CD11b, CD68, CCR7 양성 및 CD11b, CD68 양성, CCR7 음성 세포 집단의 백분율을 분석하고 기록합니다. 이소형 제어 튜브의 전압 설정을 사용하여 실험 튜브 분석을 시작합니다. CD45 APC 및 CD11b PE로 그래프를 설정합니다. 그런 다음 CD68 FITC 및 CCR7 APC-Cy7로 두 개의 그래프를 설정합니다. 샘플당 50,000개의 이벤트를 획득하고 데이터 수집 후 형광 보상을 조정합니다. CD45 및 CD11b의 유사 색상 플롯에서 CD11b 양성, CD45 음성 저 및 CD11b 양성 CD45 고세포에 대한 영역을 식별하고 분석합니다. 그런 다음 각 영역 내에서 CD68 양성 CCR7 양성 및 CD68 양성 CCR7 음성 집단을 분석합니다. 모든 분석을 통합하여 정의된 영역에서 M1 유사 및 M2 유사 미세아교세포와 대식세포의 백분율을 결정합니다. 유세포 분석 소프트웨어를 실행합니다. 유세포 분석 실험 파일을 인터페이스의 모든 샘플 섹션으로 드래그합니다. 이소타입 대조군 샘플을 두 번 클릭하여 2차원 도트 플롯을 엽니다. X축은 FSCA, Y축은 SSCA를 선택하고 직사각형 게이트 버튼을 클릭하여 세포 파편을 제외한 영역을 선택합니다. 게이트 영역을 두 번 클릭하여 새 히스토그램 플롯을 엽니다. 그런 다음 X축에 대해 FITC를 선택하고 Y축에 대해 히스토그램을 선택합니다. 영역 게이트 버튼을 클릭하여 음의 형광 신호와 양의 형광 신호 사이의 임계값을 정의합니다. 4개의 형광 항체 각각에 대해 이소타입 대조군 샘플을 사용하여 음성 신호와 양성 신호 사이의 임계값을 결정합니다. Y축의 히스토그램을 유지하면서 X축 형광색소를 PE-APC 및 APC-Cy7로 순차적으로 변경합니다. 각 히스토그램의 영역 게이트 도구를 사용하여 4개의 항체에 대한 음성 및 양성 형광 신호를 구별하기 위한 게이트를 마무리합니다. 그런 다음 실험 샘플을 두 번 클릭하여 도트 플롯을 엽니다. X축에 FSCA를 선택하고 Y축에 SSCA를 선택하고 직사각형 게이트 버튼을 클릭하여 파편을 제거한 후 모집단을 게이트합니다. 게이트 영역을 두 번 클릭하여 새 도트 플롯을 엽니다. X축에 CD11b PE를 선택하고 Y축에 SSCA를 선택합니다. 직사각형 게이트 버튼을 클릭하고 동형(isotype) 컨트롤의 PE 임계값을 사용하여 CD11b-양성 게이트를 정의합니다. 이제 CD11b 양성 영역을 두 번 클릭하여 다른 도트 플롯을 열고 X축에 CD68 FITC를 선택하고 Y축에 CCR7 APC-Cy7을 선택합니다. 크로스게이트 버튼을 클릭하고 동형에서 파생된 FITC 및 APC-Cy7 임계값을 사용하여 세포를 M1 유사 및 M2 유사 유형으로 분류합니다. CD45 높은 CD11b 양성 CD68 양성 CCR7 양성 세포의 비율은 가짜 그룹에 비해 척수 손상 또는 SCI, 비히클 그룹에서 유의하게 증가했으며 CRID3 치료는 이 수준을 변경하지 않았습니다. CD45 음성 저 CD11b 양성 CD68 양성 CCR7 양성 세포의 비율은 가짜에 비해 SCI 비히클군에서 유의하게 높았으며 CRID3 치료 후 유의하게 감소했습니다. CD11b 양성 CD68 양성 CCR7 양성 세포의 비율은 가짜에 비해 SCI 비히클 그룹에서 유의하게 증가했으며 CRID3 치료 후 유의하게 감소했습니다. CD11b 양성 CD68 양성 CCR7 음성 및 CD45 음성 낮은 CD11b 양성 CD68 양성 CCR7 음성 세포 비율은 가짜에 비해 SCI 비히클 그룹 모두에서 유의하게 감소했으며 CRID3 치료 후 증가했습니다.