Cell-free Dot Blot은 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응을 검출하기 위한 실용적이고 적응 가능한 면역분석 플랫폼입니다.

이 프로토콜은 COVID-19 팬데믹에 대응하기 위해 개발된 적응 가능하고 접근 가능하며 저렴한 면역분석 플랫폼인 cell-free dot blood 기술을 보여줍니다. 기존의 최적 표준 면역 분석 방법에는 ELISA 기법 및 측면 유동 분석법의 변형이 포함됩니다. 보고된 단백질, 전기화학적 계면 및 콜로이드 나노입자와 같은 기술을 사용한 새로운 면역분석법 개발에 상당한 관심이 있었습니다.

문제는 대부분의 최적 표준 면역 분석법이 비싸고 정교한 분자 성분 및 장비에 의존하기 때문에 중앙 집중화되지 않은 커뮤니티에서 접근할 수 없다는 것입니다. 이 새로운 CFDB 면역분석 기법은 신종 발병에 빠르게 적용할 수 있습니다. 이 솔루션은 기본 실험실 장비를 사용하며 사내에서 낮은 자원 환경에서 생산할 수 있는 분자 구성 요소에 전적으로 의존합니다.

먼저 등록 코드 P0DTC9를 사용하여 UniProt 데이터베이스에서 단백질 염기서열을 얻습니다. 최적화 도구의 IDT 코드를 사용하여 ecoli 기반 표현식에 대한 시퀀스를 최적화하는 코드. 상업적 합성을 위해 최적화된 염기서열을 물에 다시 현탁된 단일 가닥 DNA 단편으로 주문하기 전에 발현 구조 백본에 대한 SnapGene 템플릿에 최적화된 염기서열을 삽입합니다.

PCR 튜브에서 ecoli BL21 cell-free 반응에 10%PCR 산물을 첨가하여 초기 5마이크로리터 규모의 발현 검사를 수행합니다. 섭씨 30도에서 15시간 동안 흔들지 않고 반응을 배양합니다. 12%SDS 페이지 겔에 cell-free 반응 1마이크로리터를 로드하고 이를 웨스턴 블롯을 위해 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달하여 뉴클레오캡시드 단백질 또는 NP 항원의 발현 품질을 평가합니다.

cell-free dot blot assay를 위한 15 나노몰 정제 선형 발현 템플릿 제품을 사용하여 1ml 규모의 cell-free 반응을 조립합니다.15ml 원추형 튜브에서 발현 혼합물을 섭씨 30도에서 15시간 동안 80RPM으로 진탕하면서 배양합니다. 웨스턴 블롯을 사용하여 발현 품질을 평가하고 발현 혼합물 50마이크로리터를 분취한 후 부분 표본을 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 그림과 같이 96웰 플레이트의 스포팅 용량과 일치하도록 설계된 직경 2mm의 12 x 12개의 원을 포함하는 6 x 6cm 패턴이 특징인 마스터 그리드 이미지를 사용합니다.

마스터 그리드를 인쇄한 후 인쇄된 그리드를 두 층의 접착 PCR 플레이트 천장 필름 사이에 단단히 끼우고 외부 그리드 테두리를 따라 샌드위치를 크기에 맞게 자릅니다. 2mm 생검 펀치를 사용하여 그리드에 표시된 각 원의 속을 비웁니다. 6.5 x 6.5cm 크기의 니트로셀룰로오스 멤브레인 조각을 잘라 깨끗한 표면의 마스터 그리드 아래에 놓고 접착 테이프를 사용하여 고정합니다.

마커 펜을 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인의 가장 바깥쪽 원 위치를 표시하여 샘플 발견 후 멤브레인을 절단하기 위한 가이드로 사용합니다. 혈청 샘플을 PBS에서 1-10으로 희석합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 각 시료의 0.4마이크로리터 부피를 미리 결정된 그리드 위치에서 니트로셀룰로오스 멤브레인에 3회 분주합니다.

점박이 샘플을 결합하고 상온에서 10분 동안 건조시킵니다. 핀셋을 사용하여 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 조심스럽게 회수하고 표시된 바깥 쪽 원을 따라 자릅니다. 멤브레인을 10ml의 차단 용액이 들어 있는 10cm 페트리 접시로 옮깁니다.

실온에서 30분 동안 배양하면서 100RPM으로 부드럽게 흔듭니다. 냉동고에서 cell-free 항원 발현 혼합물의 50마이크로리터 분취액을 제거하고 해동 후 10cm 페트리 접시에 5ml의 차단 용액에 추가합니다. 멤브레인을 이 항원 함유 용액에 직접 옮기고 100RPM으로 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

1 시간 후, 0.05 % Tween 20을 함유 한 TBST에서 멤브레인을 헹구고 세척하십시오. 다음으로, 정제된 SpyCatcher 1밀리리터당 10마이크로그램, 2개의 정점, 2개의 단백질을 포함하는 10ml의 차단 버퍼를 멤브레인에 추가하고 SpyCatcher apex가 포함된 접시에 멤브레인을 놓습니다. 100RPM으로 흔들면서 1시간 동안 배양하고, 트리스 완충 식염수 또는 TBS로 멤브레인을 헹군 후 TBST에서 5분 동안 두 번 세척한 다음 TBS에서 마지막으로 헹굽니다.

얼룩 이미징 기기 근처의 깨끗한 작업 표면에 파라필름 조각을 붙이고 고정합니다. 멤브레인을 두드리고 핀셋을 사용하여 과도한 액체를 제거하고 파라필름 위에 놓습니다. 즉시 멤브레인 위에 3ml의 향상된 화학발광 또는 ECL 용액을 추가하고 실온에서 정확히 90초 동안 배양합니다.

멤브레인을 탭 건조한 후 화학발광 호환 이미징 기기로 옮깁니다. 기기의 이미지 분석 기능을 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인의 3개의 빈 위치를 포함한 스폿 강도를 얻을 수 있습니다. 스폿당 일정한 측정량을 유지하십시오.

데이터를 스프레드시트로 내보내 각 스폿 위치에 대한 올바른 라벨링을 보장합니다. 3배 스폿 농도의 평균과 표준 편차를 계산합니다. 모든 시료 측정에서 니트로셀룰로오스 멤브레인 배경을 뺍니다.

그런 다음 주어진 방정식을 사용하여 긍정적 또는 부정적 결과를 해석하기 위한 컷오프 값을 얻습니다. 마지막으로, 컷오프에서 뺀 데이터를 막대 그래프로 플로팅합니다. 사전 특성화된 상용 인간 Sarah에 대해 cell-free dot blot assay를 수행했으며, 해당 신호 강도 차트와 함께 블롯의 이미지가 이 그림에 제시되어 있습니다.

cell-free dot blot assay는 모든 negative control 샘플과 대부분의 positive 샘플을 성공적으로 식별했습니다. 미국 국립미생물학연구소(National Microbiology Laboratory)에서 실시한 cell-free 점 블롯 분석에 대한 독립적인 테스트를 통해 12명의 음성 환자 샘플과 12명의 양성 환자 샘플을 모두 정확하게 식별하여 그 견고성을 확인했습니다. cell-free dot blot assay는 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터 Sarah에서도 항체 반응을 검출했으며, 재감염 5일 후 수집된 24개의 감염 후 샘플 중 18개에서 양성 신호가 관찰되었으며 모든 감염 전 샘플은 음성을 유지했습니다.