유세포 분석에 의한 Juvenile Gilthead Seabream Head Kidney Leukocytes 의 분리, 고정 및 특성화

이 프로토콜은 유세포 분석을 통해 도미의 머리 신장에서 백혈구의 분리, 고정 및 생존 가능성 평가를 표준화하여 품질 저하 없이 고처리량 샘플 처리를 가능하게 합니다.

Neubauer 챔버를 사용한 수동 세포 계수 및 염색된 혈액 도말과 같은 전통적인 기술은 어류 면역학에서 일반적입니다. 유세포 분석법이 대중화되고 있지만 어류 연구에서의 적용은 여전히 제한적입니다. 전통적인 어류 면역학 방법은 간 집약적이며 오류가 발생하기 쉽습니다. 어린 동물 연구는 순수 백혈구를 얻는 데 어려움이 있고 즉각적인 생존 가능성 평가의 필요성으로 인해 샘플 처리량이 제한됩니다.

이 프로토콜은 주요 백혈구 집단을 식별하고 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별함으로써 상세한 면역 세포 분석을 가능하게 합니다. 고정은 한 달 동안 생존 가능성을 유지하여 확장 가능하고 유연하며 효율적인 유세포 분석 워크플로우를 가능하게 합니다.

우리의 연구 결과는 면역 메커니즘과 세포 생존력에 대한 환경적 영향을 밝혀 어류 면역학을 발전시키고 양식업에서 개선된 질병 관리 전략 개발을 돕습니다.

[해설자] 시작하려면 안정적인 환경을 유지하기 위해 물을 지속적으로 여과하고 재순환하는 재순환 양식 시스템에 어린 금박 도미인 Sparus aurata를 적응시킵니다. 최적의 비생물적 매개변수를 유지하기 위해 시스템에 기계적 및 생물학적 여과, 폭기 및 온도 제어가 포함되어 있는지 확인하십시오. 연구의 특정 요구 사항에 따라 광 주기, 온도, 염도, pH 및 용존 산소 수준과 같은 환경 요인을 조정합니다. 그물을 사용하여 어린 금박 도미 물고기를 탱크 물이 채워진 임시 보관 용기로 부드럽게 옮깁니다. 물고기를 안락사시킨 후 멸균 해부 트레이에 물고기 한 마리를 옆으로 눕힙니다. 메스를 사용하여 통풍구에서 아가미 쪽으로 물고기의 복부 정중선을 따라 조심스럽게 절개합니다. 해부 가위를 사용하여 절개 부위를 확장하고 내부 장기를 노출시킵니다. 체강의 전방 등쪽 부위 근처의 아가미 바로 뒤에 위치하고 척추 아래 상단을 따라 확장되는 머리 신장을 찾습니다. 끝이 가는 집게와 가위를 사용하여 주변 조직을 조심스럽게 제거하여 머리 신장을 더 잘 시각화합니다. 그런 다음 머리 신장을 들어 올리고 주변을 정밀하게 절단하여 주변 조직에서 벗어나게 합니다. 절제된 머리 신장을 멸균 페트리 접시 내에 배치된 세포 스트레이너에 즉시 넣습니다. 멸균 페트리 접시에 2밀리리터의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)을 피펫팅합니다. 주사기의 플런저를 사용하여 세포 여과기에 절제된 두부 신장을 침용하여 세포를 용액으로 방출합니다. 다음으로 밀도 구배 매체 용액을 준비합니다. 밀도 구배 배지 용액 600마이크로리터를 5밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 피펫팅합니다. 페트리 접시에서 2밀리리터의 세포 현탁액을 각 튜브로 천천히 옮깁니다. 브레이크를 끈 상태에서 섭씨 4도에서 45분 동안 400g에서 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브를 제거하고 백혈구 고리를 관찰합니다. 그런 다음 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 약 100마이크로리터의 백혈구 고리를 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 이제 HBSS로 부피를 2밀리리터로 채우고 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 400g에서 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브 바닥의 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 버립니다. 그런 다음 최종 세포 농도가 밀리리터당 10,000 내지 100만 세포가 될 때까지 정제된 펠릿을 HBSS 1밀리리터에 재현탁합니다. 반응성 염료가 들어 있는 바이알에 50마이크로리터의 디메틸 설폭사이드를 첨가합니다. 세포 밀도를 밀리리터당 100만 개의 세포로 조정한 후 세포 현탁액 1밀리리터를 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 주어진 대로 생존율 조절 샘플을 준비합니다. 튜브 3과 4를 섭씨 70도의 수조에 7분 동안 넣어 세포 사멸을 유도합니다. 세포를 염색하려면 재구성된 형광 염료 1마이크로리터를 1밀리리터의 세포 현탁액이 들어 있는 튜브 2와 4에 피펫팅하고 잘 혼합합니다. 염색된 튜브를 빛으로부터 보호한 실온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, HBSS 1밀리리터로 세포를 두 번 세척하고 최종 펠릿을 동일한 완충액의 900마이크로리터에 재현탁합니다. 그런 다음 100 마이크로리터의 37% 포름알데히드를 피펫으로 넣어 세포를 고정하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 1% BSA를 함유한 HBSS 1밀리리터로 세포를 두 번 세척한 후, 동일한 용액 1밀리리터에 재현탁합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 냉장고에 최대 1개월 동안 보관하십시오. 고정된 샘플 튜브를 유세포 분석기 샘플 포트에 넣어 분석합니다. 일중항 게이트 내의 각 샘플에 대해 최소 10,000개의 이벤트를 기록합니다. 모든 데이터를 저장하고 외장 드라이브나 클라우드 스토리지에 백업하세요. 세포 크기와 세분성을 평가하기 위해 전방 산란 영역과 측면 산란 영역을 플로팅하여 유세포 분석 데이터를 시각화합니다. 일중항 셀 게이팅을 수행하고 전방 산란 영역 대 전방 산란 높이를 플로팅하여 다중항을 제외합니다. 전방 대 측면 산란 프로파일을 기반으로 세 가지 백혈구 집단을 식별합니다. 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 해당 형광 채널에서 생존율 염료 염색에 대한 임계값을 설정합니다. 최적의 조건에서 림프구, 단핵구, 과립구는 각각 백혈구 집단의 31%, 38%, 31%를 차지한 반면, 열 스트레스 하에서는 림프구가 21.3%로 감소하고 단핵구가 45.6%로 증가했으며, 과립구는 33.1%로 안정적으로 유지되었습니다. 최적의 조건에 노출된 샘플은 모든 백혈구 집단에서 살아있는 세포가 우세하여 더 높은 생존율을 나타냈습니다. 대조적으로, 열 스트레스를 받은 샘플은 세포 사멸이 크게 증가한 것으로 나타났습니다.