2025년 6월 13일
전기천공법(Electroporation)은 펄스 전기장(PEF)을 사용하여 세포 배양에 일시적인 공극을 만들어 분자 화물을 도입하는 것입니다. 이 기술은 최근 연구 및 임상 환경에서 널리 사용되고 있습니다. 여기에서는 최근 개발된 "Electroporation Cytometry System"을 사용하여 살아있는 세포, 형광 현미경 검사를 수행하기 위한 전기천공법 기술에 대해 설명합니다.
이 연구의 범위는 펄스 전기장이 세포 거동에 미치는 영향, 특히 전기천공이 세포 주기에 미치는 영향에 중점을 둡니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 최대 72시간 동안 포유류 세포 배양을 사용하여 지속적인 살아있는 세포 전기천공 실험을 수행할 수 있다는 것입니다. 우리 연구실은 이러한 기술을 미세유체학에 적용하는 데 중점을 두고 있으며, 이를 통해 샘플 크기를 줄이고 시약 요구 사항을 줄이며 향후 프로토콜을 위한 더 나은 샘플 제어를 가능하게 합니다.
[해설자] 시작하려면 10% FBS 및 1% 페니실린 스트렙토마이신을 함유한 10밀리리터의 DMEM 고포도당으로 10센티미터 플레이트에서 U2OS FUCCI CA5 세포를 배양합니다. 플레이트를 5% 이산화탄소 환경에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양액이 80% 합류도에 도달하면 플레이트에서 배지를 흡인합니다. PBS로 세포를 세척한 다음 0.25% 트립신 1밀리리터를 첨가하고 1.5분 동안 배양하여 세포를 해리시킵니다. 해리된 세포를 5밀리리터의 DMEM 고포도당에 재현탁시켜 트립신을 중화합니다. 재현탁된 배양물에서 100마이크로리터 샘플을 채취하여 전기천공 세포 분석 시스템 챔버 내부의 하단 유리 커버 슬립에 놓습니다. 샘플을 도입한 후 챔버가 30% 합류하는지 확인하십시오. 챔버의 맨 끝에 4밀리리터의 DMEM 고포도당을 천천히 첨가하여 액체가 샘플을 씻어내는 것을 방지합니다. 표준 현미경 슬라이드를 챔버 위에 놓고 챔버를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 배양합니다. 환경 제어 챔버가 있는 도립 형광 현미경을 켜서 전기천공 전에 시스템이 안정화되도록 합니다. 환경 챔버가 안정화되는 동안 악어 클립 케이블을 사용하여 디지털 멀티미터를 펄스 발생기 커패시터 및 고전압 스위치에 연결하여 전기 천공 챔버를 신속하게 설정합니다. 이제 현미경에서 20배 배율을 선택합니다. 현미경 소프트웨어에서 FUCCI CA5 시스템의 두 형광 단백질에 해당하는 FITC/GFP 및 A594 Texas Red M Cherry 채널이 선택되었는지 확인합니다. 장시간 이미징 중 사진 손상을 방지하기 위해 일반적으로 0.05초 미만의 낮은 노출 설정을 사용하십시오. 타임랩스 이미징을 시작하기 전에 테스트 이미지를 촬영하여 이미지 초점과 품질을 최적화합니다. 24시간 동안 10분마다 3-6개의 서로 다른 시점에서 이미지를 캡처하도록 타임랩스를 프로그래밍하여 사진 손상을 완화하면서 타임랩스당 많은 양의 세포 주기 데이터를 얻습니다. A594 채널에 대해 자동 초점이 활성화되어 타임랩스 동안 문화권 추적을 최적화해야 합니다. 전기천공이 완료될 때까지 소프트웨어를 열어 두십시오. 전기천공 세포 분석 챔버를 적절한 환경 챔버가 장착된 현미경에 넣습니다. 전기천공 전에 챔버를 닫은 상태로 유지하고 적절한 세포 주기 조건을 유지하기 위해 환경 시스템이 계속 작동하는지 확인하십시오. 환경 챔버를 열고 디지털 멀티미터를 펄스 발생기에 부착한 다음 악어 클립 케이블을 사용하여 펄스 발생기를 챔버 전극에 연결합니다. 펄스 발생기 커패시터를 180V로 충전합니다. 디지털 멀티미터가 0볼트를 표시할 때까지 펄스를 챔버로 빠르게 방전합니다. 최적의 배양 조건을 보장하기 위해 챔버에서 모든 전기 연결을 제거하고 즉시 챔버 뚜껑을 교체하십시오. 환경 챔버가 제자리에 단단히 고정되면 즉시 타임랩스 이미징을 활성화하십시오. 타임랩스가 완료된 후 현미경 소프트웨어를 사용하여 캡처된 모든 이미지를 단일 비디오로 저장합니다. 시각적 품질을 조정하여 수동 정량화를 위해 세포 특징의 선명도를 향상시킵니다. 마지막으로 시간 경과에 따른 FITC 및 A594 신호의 변화를 관찰하여 타임랩스 비디오에서 세포 위상을 추적합니다. Fuji 시스템을 사용하여 단백질 발현 및 유비퀴틴화와 관련된 색상 변화를 추적하여 시각적 데이터를 수집하여 G1, S, G2, M 단계를 명확하게 구별할 수 있었습니다. 이를 통해 다양한 조건에서 세포 주기 진행을 직접 관찰할 수 있었습니다. 이 그림은 비동기화 및 S상 동기화 세포 배양을 사용한 두 세트의 실험에서 수집된 주요 데이터의 요약을 제공합니다. 동기화되지 않은 셀에서 펄스 전기장 노출은 G1, G2 및 M 상의 평균 길이를 크게 증가시킨 반면 S 상은 변하지 않았습니다. 동기화된 세포에서 펄스 전기장 노출로 인해 G1, S 및 G2 단계의 지속 시간이 감소했지만 S와 G2만 통계적으로 유의한 반면 M 단계는 영향을 받지 않았습니다.
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이 기사는 분자 화물 도입을 위해 세포 배양에 일시적인 구멍을 만드는 펄스 전기장을 이용하는 기술인 전기 침투법에 대해 논의합니다. 생존 세포 형광 현미경을 위한 "전기 침투법 세포 계측 시스템" 사용에 중점을 둡니다.
Electroporation cytometry enables real-time, quantitative analysis of live-cell responses to pulsed electric fields, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The protocol's integration with fluorescence microscopy and cell cycle reporters provides actionable insights into cell phase dynamics under experimental perturbation. This capability strengthens predictive confidence at key inflection points in the discovery pipeline.
This protocol bridges early discovery and preclinical workflows by enabling continuous, quantitative monitoring of live-cell responses to pulsed electric fields.