복잡한 분변 군집의 지속적인 배양을 위한 Bioreactor Assembly

우리는 숙주 박테리아의 상호 작용과 내인성 및 외인적 요인이 건강에 미치는 영향을 연구하며, 암 발병, 진행 및 치료 반응에 대한 박테리아의 영향에 중점을 둡니다. 우리는 박테리아 군집에서 항 PD-1 면역 관문 억제제를 연구하여 박테리아 대사 산물이 항 PD-1 요법 효능을 향상시키는 것을 발견했습니다.

생체 내 마이크로바이옴에 대한 숙주 인자의 영향을 분리하는 것은 여러 가지 영향으로 인해 어렵습니다. 미생물반응기 어레이를 사용하면 특정 공정을 제어하여 미생물 군집에 대한 직접적인 영향을 명확히 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 통제된 조건에서 배설물 군집을 배양하는 비용 효율적인 방법을 제공하는 동시에 연구자가 비교적 빠르게 병렬로 실험을 실행할 수 있도록 합니다.

[강사] 시작하려면 3D 프린팅된 6웰 반응기 어레이를 얻으십시오. 1/8인치 PTFE 튜브에서 25mm 스트립 12개를 자르고 면도기를 사용하여 끝을 면도합니다. 각 스트립의 한쪽 끝을 25-28 나사 피팅이 있는 수 루어의 나사 구멍에 삽입합니다. 피팅을 지정된 폐기물 및 샘플 어레이의 구멍에 단단히 나사로 고정합니다. 이제 각 반응기 웰에 마이크로 교반 막대를 삽입합니다. 각 반응기 웰의 소스 구멍에 수형 1/4-28 나사산을 나사로 고정합니다. 암 루어 호스 바 어댑터 피팅을 각 반응기 웰의 폐기물 및 소스 연결을 위한 나사 피팅에 나사로 고정합니다. 그런 다음 암 루어 X를 3-32/2인치 호스 미늘 어댑터 피팅에 나사로 고정하여 샘플 포트용 1/4-28 나사 피팅에 고정합니다. 호스 미늘 어댑터 위에 고무 격막을 놓고 상단을 접습니다. 다음으로, 폐기물 및 소스 라인용 E-LFL 2.06mm 튜브 두 세트를 절단합니다. 더 쉽게 부착할 수 있도록 뜨거운 물을 사용하여 튜브를 부드럽게 하십시오. 소스 및 폐기물 연결을 위해 튜브를 암 Luer X-1/8인치 호스 미늘 어댑터 피팅에 연결합니다. 이제 튜브의 다른 쪽 끝에 1/8인치 호스 미늘 어댑터에 맞는 잠금 링 X가 있는 수 루어를 고정합니다. 암 Luer X를 1/16인치 호스 미늘 어댑터에 고정합니다. 적절한 크기의 2정지 튜브를 해당 소스 및 폐기물 연결부에 연결합니다. 그런 다음 다른 암 Luer X-1/16인치 호스 미늘 어댑터를 튜브의 다른 쪽 끝에 고정합니다. 모든 소스 및 폐기물 피팅에 대해 이 작업을 반복한 후 잠금 링 X가 있는 수 루어를 1/8인치 호스 미늘 어댑터 피팅에 E-LFL 2 튜브 조각에 삽입합니다. 모든 부품에 대해 각 2스톱 튜브 섹션의 끝에서 비어 있는 암 Luer X-16인치 호스 미늘 어댑터에 한쪽 끝을 부착합니다. 모든 소스 및 폐기물 피팅에 대해 이 작업을 반복한 후 암 루어 T의 반대쪽 끝을 사용하여 원자로 웰 1 및 2의 소스 라인용 E-LFL 2.06mm 튜브를 연결합니다. 그런 다음 T의 중간 출구에 양쪽 끝에 잠금 링 X에서 1/8인치 어댑터 피팅이 있는 수 루어로 5cm 튜브 조각을 고정하여 두 번째 T 접합부로 연결합니다. 이제 세 번째 반응기용 E-LFL 2.06mm 소스 튜브를 두 번째 T의 반대쪽에 연결합니다. 한쪽 끝에 잠금 링 X-1/8인치 어댑터가 있는 수 루어와 다른 쪽 끝에 잠금 링 X-1/8인치 어댑터가 있는 암 루어가 있는 또 다른 5cm 튜브 세그먼트를 부착합니다. 그런 다음 잠금 링 X가 있는 수 루어를 1/8인치 호스 미늘 어댑터 피팅에 25cm E-LFL 2.06mm 튜브 조각의 한쪽 끝에 부착합니다. 암 Luer X-1/8인치 호스 미늘 어댑터를 다른 쪽 끝에 고정하고 알루미늄 호일로 덮습니다. 폐기물 수거 병을 조립하려면 2 개의 구멍이 있는 캡을 2 리터 병에 느슨하게 고정하십시오. 캡의 양쪽 구멍에 수 1/4-28 나사 피팅을 삽입합니다. 그런 다음 1/8인치 호스 미늘 어댑터가 있는 암 루어를 캡에 미리 부착된 PTFE 튜브에 연결되지 않는 수나사 피팅에 부착합니다. 5cm 길이의 E-LFL 2.06mm 튜브를 병의 호스 미늘 어댑터에 연결합니다. 호일로 덮기 전에 잠금 링 X가 있는 수 루어를 1/8인치 호스 미늘 어댑터에 튜브의 다른 쪽 끝에 부착합니다. 마지막으로 병뚜껑 전체를 알루미늄 호일로 덮은 후 섭씨 121도 및 15psi에서 45분 동안 고압멸균합니다. 고압멸균이 완료되면 피팅과 호일 씰을 조이고 사용하기 전에 48시간 동안 반응기를 혐기성 챔버에 넣습니다. 혐기성 챔버 내부의 반응기 어레이를 1,600 RPM으로 설정된 자기 교반 플레이트 위에 정렬합니다. 그런 다음 소스 및 폐기물 라인 모두에 대한 2정지 튜브를 해당 연동 펌프의 클램프에 장착합니다. cl을 잠그십시오.amps 사용 전 25시간 이내에 완료된 경우. 그렇지 않으면 튜브의 마모를 줄이기 위해 느슨하게 두십시오. 이제 소스 병에서 호일 캡을 제거합니다. 피팅을 수 루어-1/4-28 나사산 피팅에 나사로 고정하여 이 개구부가 내부 PTFE 튜브에 연결되었는지 확인합니다. 호일 캡을 제거하고 0.22마이크로미터 주사기 필터를 소스 병과 폐기물 병의 5cm 통풍구 라인에 부착합니다. 적당한 속도로 흐름을 시작하여 반응기 채우기를 시작합니다. 각 반응기 웰 내부의 허리선 튜브가 소스 튜브보다 낮게 위치하여 각 웰이 과도하게 채워지거나 완전히 비워지는 것을 방지하십시오. 반응기가 채워지기 시작하면 밤새 가스를 제거하기 위해 반응기를 떠나기 전에 모든 우물이 동일한 부피에 도달하고 매체가 허리선으로 흐르는지 확인하십시오. 실험 재료를 혐기성 챔버로 24시간 동안 옮기는 것부터 시작합니다. 필요한 대변 접종량을 계산한 후, 극저온 바이알에 보존된 대변 샘플을 혐기성 챔버로 옮기고 15분 동안 해동시킵니다. 넓은 구경의 피펫 팁을 사용하여 극저온 바이알의 배설물을 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 밀봉된 튜브를 200g에서 5분 동안 원심분리하여 미립자를 침전시킵니다. 튜브를 혐기성 챔버로 다시 옮깁니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다. 오토클레이브 실험실 주걱을 사용하여 5.7g의 대변 고형물을 새로운 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 17.1밀리리터의 혐기성 멸균 식염수를 튜브에 넣고 단단히 밀봉합니다. 이제 앞서 설명한 대로 원심분리하기 전에 튜브를 5분 동안 소용돌이치게 합니다. 10% 표백제 실험실 물티슈를 사용하여 각 반응기 상단의 격막을 최소 2분 동안 멸균합니다. 샘플을 혐기성 챔버로 되돌린 후 상층액을 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브로 피펫팅합니다. 이제 3.8밀리리터의 대변 슬러리 상청액을 16게이지 1.5인치 바늘이 장착된 6개의 개별 5밀리리터 주사기에 옮깁니다. 반응기 격막에서 표백제 물티슈를 제거합니다. 그런 다음 중격을 통해 바늘을 삽입하고 반응기를 밤새 방치하기 전에 각 반응기에 3.8밀리리터의 배설물 슬러리를 천천히 주입합니다. 16-18시간 배양 후 반응기로의 흐름을 시작합니다. 대변 슬러리를 주입한 직후 마그네틱 교반판을 최대 속도로 설정합니다. 두 복제 반응기의 미생물 군집 구성은 시간이 지남에 따라 변화했으며 다른 종은 며칠에 걸쳐 다양한 상대적 풍부도를 보였습니다. 클로스트리디움 속과 같은 까다로운 혐기성 박테리아는 모든 시점에서 각 반응기에서 일관되게 검출되었습니다.