Name: 정점 아웃 장 오가노이드 생성 및 EdU-라벨링을 사용한 오가노이드 증식 속도 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:57:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: 배우세요 성체 줄기세포 유래 장 오가노이드의 극성 반전 유도 및 EdU 라벨링을 활용한 증식 평가 방법입니다. 이 기술은 정점 아웃 오가노이드에서 세포 표면 접근성을 개선하여 장 생물학 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+suppresses+Wnt+signaling+via+the+Bcl11b-regulated+NuRD+complex+to+maintain+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">BMP suppresses Wnt signaling via the Bcl11b-regulated NuRD complex to maintain intestinal stem cells.</a> EMBO J. 43 (23), 6032-6051 (2024).</li>
<li>Gaowa, A., Leangpanich, S., Park, E. J., Kawamoto, E., Shimaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irisin+promotes+intestinal+epithelial+cell+proliferation+via+Wnt%2F%CE%B2-catenin+and+focal+adhesion+kinase+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Irisin promotes intestinal epithelial cell proliferation via Wnt/β-catenin and focal adhesion kinase signaling pathways.</a> Sci Rep. 14, 25702(2024).</li>
<li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+quiescence+of+Lgr5%2B+stem+cells+in+intestinal+organoids+enables+differentiation+of+hormone-producing+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).</li>
<li>Ludikhuize, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+define+intestinal+stem+cell+differentiation+downstream+of+a+FOXO%2FNotch+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondria define intestinal stem cell differentiation downstream of a FOXO/Notch axis.</a> Cell Metab. 32 (5), 889-900.e7 (2020).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%281979%29%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science (1979). 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nat Med. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Joo, S. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+intestinal+apical-out+organoid+model+for+gut+function+study%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study.</a> Animals. 12 (3), 372(2022).</li>
<li>Co, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+epithelial+polarity%3A+A+human+enteroid+model+for+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions.</a> Cell Rep. 26, 2509-2520.e4 (2019).</li>
<li>Sasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+scalable+coculture+system+for+gut+anaerobes+and+human+colon+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of a scalable coculture system for gut anaerobes and human colon epithelium.</a> Gastroenterology. 159 (1), 388-390.e5 (2020).</li>
<li>Mayorgas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+study+the+invasive+capability+of+adherent-invasive+escherichia+coli+by+using+human+primary+organoid-derived+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to study the invasive capability of adherent-invasive escherichia coli by using human primary organoid-derived epithelial monolayers.</a> Front Immunol. 12, 646906(2021).</li>
<li>Csukovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralising+effects+of+different+antibodies+on+clostridioides+difficile+toxins+TcdA+and+TcdB+in+a+translational+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutralising effects of different antibodies on clostridioides difficile toxins TcdA and TcdB in a translational approach.</a> Int J Mol Sci. 24 (4), 3867(2023).</li>
<li>Csukovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+reversal+of+canine+intestinal+organoids+reduces+proliferation+and+increases+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Polarity reversal of canine intestinal organoids reduces proliferation and increases cell death.</a> Cell Prolif. 57 (2), e13544(2023).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+differentiating+and+long-living+intestinal+organoids+reflecting+the+cellular+diversity+of+canine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of differentiating and long-living intestinal organoids reflecting the cellular diversity of canine intestine.</a> Cells. 9 (4), 822(2020).</li>
<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., O'Connor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+infection+in+3D+tissue-derived+human+organoid+culture+systems+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying infection in 3D tissue-derived human organoid culture systems by microinjection.</a> J Vis Exp. (151), e59610(2019).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+SLC26A3+expression+and+function+in+intestinal+epithelial+cells+in+response+to+Cryptosporidium+parvum+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased SLC26A3 expression and function in intestinal epithelial cells in response to Cryptosporidium parvum infection.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 317 (6), C1205-C1212 (2019).</li>
<li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Curr Opin Immunol. 48, 15-22 (2017).</li>
<li>Csukovich, G., Pratscher, B., Burgener, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+world+of+organoids%3A+Gastrointestinal+disease+modelling+in+the+age+of+3R+and+one+health+with+specific+relevance+to+dogs+and+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The world of organoids: Gastrointestinal disease modelling in the age of 3R and one health with specific relevance to dogs and cats.</a> Animals. 12 (18), 2461(2022).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+more+perfect+union%3A+Modeling+intestinal+bacteria-epithelial+interactions+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Creating a more perfect union: Modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 769-782 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+porcine+intestinal+organoids%3A+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> J Virol. 94 (21), e01006-e01020 (2020).</li>
<li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+ovine+gastric+and+intestinal+organoids+for+studying+ruminant+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The development of ovine gastric and intestinal organoids for studying ruminant host-pathogen interactions.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 733811(2021).</li>
<li>Nash, T. J., Morris, K. M., Mabbott, N. A., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside-out+chicken+enteroids+with+leukocyte+component+as+a+model+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Inside-out chicken enteroids with leukocyte component as a model to study host-pathogen interactions.</a> Commun Biol. 4 (1), 377(2021).</li>
<li>Hanson, K. I., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tissue+response+to+Shiga+toxin+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Intestinal tissue response to Shiga toxin exposure.</a> mBio. 15 (9), e0123224(2024).</li>
<li>Hovhannisyan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+human+organoids+supports+an+intestinal+niche+for+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Infection of human organoids supports an intestinal niche for Chlamydia trachomatis.</a> PLoS Pathog. 20 (8), e1012144(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Biologix</td><td>07-6024</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I 인간, &ge; 95% (HPLC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G-9145</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 18 웰 유리 바닥</td><td>ibidi</td><td>81817</td><td></td></tr><tr><td>100X 페니실린-스트렙토마이신 보충제 미디어</td><td>Gibco / Thermo</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01 &nbsp;</td><td>토크리스 바이오사이언</td>스 <td>2939/10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>접착 방지 헹굼 솔루션</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>arivis Pro&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>버전 4.2.2</td><td></td></tr><tr><td>B27 무혈청 보충제(50X), 액체</td><td>Gibco/Thermo</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bisbenzimide H 33342(Hoechst 33342)</td><td>Abcam</td><td>ab145597</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>이미징용 Click-iT EdU 세포 증식 키트, Alexa Fluor 647 염료</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco/Thermo</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco/Thermo</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제&nbsp;</td><td>Gibco/Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충액 1M, 액체</td><td>Gibco/Thermo</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>인간 FGF-염기성</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-100&micro; G</td><td></td></tr><tr><td>인간 HGF&nbsp;</td><td>페프로테크</td><td>100-39-100&micro; G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인간 IGF-I&nbsp;</td><td>페프로테크</td><td>100-11-100&micro; G</td><td></td></tr><tr><td>인간 NOGGIN(포유류)&nbsp;</td><td>페프로테크</td><td>120-10C-200&micro; G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸-L-시스테인, 세포 배양 테스트, 바이오시약&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9165-5G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>오가노이드 수확 용액</td><td>Thermo</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Triton(TM) X-100, 분자 생물학용</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드</td><td>Gibco/Thermo</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

정점 아웃 장 오가노이드 생성 및 edu-라벨링을 사용한 오가노이드 증식 속도 평가

Generation of Apical-Out Intestinal Organoids and Assessment of Organoid Proliferation Rate Using EdU-Labeling

트립신화 후 3일 동안 성장한 오가노이드는 그림 2A와 같이 50-250μm가 이상적이어야 합니다. 이보다 상당히 큰 오가노이드는 극성을 효율적으로 역전시키지 못할 수 있습니다. 더 큰 오가노이드도 싹트기 시작할 수 있으며, 우리는 이러한 오가노이드가 효율적인 극성 반전에도 문제가 있을 수 있다는 것을 알게 되었습니다. Basal-out 및 apical-out 오가노이드는 명시야 이미징에서 이미 명백한 형태학적 차이를 나타냅니다. 기저 아웃 오가노이드는 현탁 배양 3일 후에도 큰 내강(그림 2B)을 유지하는 반면, 정점 아웃 오가노이드(그림 2C)는 더 조밀한 것으로 보입니다. 정점 아웃 현탁액 배양의 매우 구체적인 특징은 오가노이드 주위를 떠다니는 죽은 세포...

정점 아웃 장 오가노이드 생성 및 EdU-라벨링을 사용한 오가노이드 증식 속도 평가

Here, we describe the generation of floating cultures of apical-out intestinal organoids from hydrogel-embedded intestinal organoid cultures. ...

generation-apical-out-intestinal-organoids-assessment-organoid

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

기본 생쥐 대장 종양 organoid을 설정하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 대장 종양 세포가 생존하고 상피 정상적인 결장하지 않는 반면, 제한된 성장 인자를 포함하는 미디어 organoids로 성장하는 기능을 사용합니다.

기본 마우스 대장 종양의 체외 Organoid의 문화

여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

장 organoid 문화 전체 지하실에서 설정 되 고 셀 전용 패션에 자기 갱신과 차별화의 분석을 허용 하지 않습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 정렬 된 줄기 (Lgr5+)의 재구성, 틈새 (Paneth) 세포, 그들의 이전 생 화 확 및 유전 수정 및 기능 분석 하는 동안 organoids을 일으키.

장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라)

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

이 프로토콜은 기본 Lgr5-positve organoid 문화와 레트로 바이러스 전달의 후속 성능을 설명합니다. 이 시험관의 Organotypic에 소설에서 수행 할 기능 연구를 전달 유전자의 Cre 호텔 유도 과발현 또는 최저을 가능하게하고 있습니다   모델 시스템.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

배우세요 성체 줄기세포 유래 장 오가노이드의 극성 반전 유도 및 EdU 라벨링을 활용한 증식 평가 방법입니다. 이 기술은 정점 아웃 오가노이드에서 세포 표면 접근성을 개선하여 장 생물학 연구에 활용됩니다.

정점 아웃 장 오가노이드 생성 및 EdU-라벨링을 사용한 오가노이드 증식 속도 평가

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