HepG2 세포에서 대사적으로 조절되는 Akt 활성화 역학의 Live-Cell Förster Resonance Energy Transfer Imaging

세포 이질성은 본질적으로 평균화된 세포 역학의 복잡성을 정확하게 설명하는 데 장애물이 됩니다. 이것이 우리가 단일 세포를 이미지화하기 위해 여기에 있는 이유입니다. 유전적으로 암호화된 FRET 바이오센서의 최근 개발은 특이성을 향상시켰고 세포 내 Akt의 실시간 추적에 혁명을 일으켰으며, 이는 이종유전을 이해하고 맞춤형 약물 요법을 개발하는 데 중요한 역할을 합니다.

암과 당뇨병은 복잡한 대사 경로를 통해 발생합니다. 암에서 인슐린 신호 전달 경로의 생체 복합체를 해독하기 위해 단일 세포 해상도에서 최첨단 생세포 FRET 이미징을 사용합니다. 우리는 레이저 출력을 미세 조정하고 검출기 이득을 조정하는 것과 함께 공초점 현미경, 하드웨어 및 소프트웨어 구성을 최적화하는 것이 FRET 신호의 노이즈 및 스펙트럼 누화를 최소화하는 데 중요하다는 것을 발견했습니다.

웨스턴 블로팅과 같은 전통적인 벌크 방법은 공간적 시간적 세부 사항이 부족하고 세포 이질성을 가립니다. 우리의 프로토콜은 살아있는 세포 FRET 이미징을 사용하여 높은 정밀도와 정확도로 세포 반응을 포착함으로써 이러한 격차를 메웁니다. 시작하려면 1밀리리터당 0.1밀리그램의 폴리-L-라이신 용액을 이미징 접시에 넣고 접시를 흔들어 전체 표면을 덮습니다.

하룻밤 배양 후 접시에서 과도한 폴리-L-라이신 용액을 흡인합니다. PBS로 표면을 3회 부드럽게 헹구고 각각 5분 동안 휴지시켜 결합되지 않은 폴리-L-라이신을 완전히 제거합니다. PBS를 흡인하고 코팅된 이미징 접시를 섭씨 37도에서 최소 3시간 동안 자연 건조시킵니다.

다음으로, 형질감염 24-48시간 전에 사전 코팅된 이미징 접시에 HepG2 세포를 시딩하여 70-90% 합류에 도달하도록 합니다. Forster Resonance Energy Transfer 바이오센서를 암호화하는 플라스미드와 함께 형질감염 시약을 해동하고 소용돌이치게 합니다. 짧은 회전을 수행하여 튜브 바닥에 있는 모든 혼합물을 수집합니다.

8마이크로그램의 플라스미드를 반응 완충액과 혼합하여 고속으로 5초 동안 와류를 사용하여 최종 부피 100마이크로리터가 됩니다. 튜브 바닥에 혼합물을 모으기 위해 짧게 회전합니다. 희석된 혈장 DNA가 들어 있는 튜브에 2.4마이크로리터의 형질감염 폴리머를 넣고 잘 혼합합니다.

바이오센서와 폴리머 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 나노입자 복합체가 형성되도록 합니다. 튜브를 5, 000G에서 5초 동안 회전시켜 바닥에 내용물을 모으십시오. 전체 100마이크로리터의 나노입자 복합체 용액을 세포 배양 배지에 적가하고 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 혼합합니다.

플레이트를 섭씨 37도에서 4시간에서 밤새 배양합니다. 세포에서 나노입자 복합체를 제거한 후 용액을 2밀리리터의 신선한 완전 성장 배지로 교체합니다. 분석 시간까지 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터로 되돌립니다.

형광 현미경으로 세포를 분석합니다. 이미징 접시에서 배양 배지를 제거하고 접시를 1X PBS로 두 번 헹구고 각 헹굼이 5분 동안 지속되도록 합니다. 접시 가장자리 주위의 각 접시에 2밀리리터의 기아 배지를 추가합니다.

세포를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 컴퓨터를 켠 다음 공초점 현미경 본체와 액세서리의 전원을 순차적으로 켭니다. 그런 다음 키를 켜짐 위치로 돌리고 레이저 발사 토글 스위치를 켜서 레이저 시스템을 활성화합니다.

그런 다음 레이저 잠금 스위치를 시계 방향으로 돌려 두 레이저 라인의 켜짐 위치로 돌립니다. 마지막으로 시스템 컨트롤러 전원을 켭니다. 데스크탑에서 NIS-Elements AR 소프트웨어를 실행합니다.

획득을 위해 A1을 클릭하여 이미징 설정을 시작하고 실험 요구 사항에 따라 적절한 광학 구성을 선택합니다. 현미경 무대 상단 인큐베이터를 설치하고 나사로 고정합니다. 내부 수조를 멸균된 이중 증류수로 채웁니다.

그런 다음 상단 히터를 설치하고 스테이지 히터, 목욕 히터, 렌즈 히터의 전원을 켭니다. 40% 에탄올을 적신 렌즈 페이퍼로 95X 오일 이멀젼 렌즈를 닦고 대물 렌즈에 작은 이멀젼 오일 방울을 올려 놓습니다. 그런 다음 HepG2 세포가 들어 있는 이미징 접시를 현미경 스테이지에 놓고 홀더로 고정합니다.

챔버를 닫고 평형을 위해 세포를 1-2시간 동안 배양합니다. NIS-Elements AR의 파일 메뉴에서 ND 획득 창을 시작합니다. 시간 탭을 선택하여 타임랩스 이미징의 간격, 지속 시간 및 루프를 설정합니다. XY 탭을 클릭하고 추가 버튼을 눌러 초점 이미징을 위한 HepG2 세포를 포함합니다.

그런 다음 Z 상자를 선택하여 Z 위치를 설정합니다. 찾아보기를 클릭하여 대상 폴더를 선택합니다. 파일 이름 상자에 실험 이름을 입력합니다.

지금 실행을 클릭하여 획득을 시작하고 타임랩스 이미징 프로세스를 시작합니다. 인슐린 보충 배지 없이 최대 30분 동안 기본 측정값을 기록합니다. 정기적으로 이미징을 일시 중지합니다.

유리 바닥 접시에서 배지를 부드럽게 제거하고 적절한 인슐린 농도가 보충된 배지 1밀리리터를 추가합니다. 이미지 획득을 다시 시작하고 실험이 끝날 때 마침을 클릭하여 닫습니다. 마지막으로, 분석을 위해 획득한 이미지를 백업하고 안전하게 저장합니다.

인슐린 자극 시 Akt 인산화의 용량 의존적 증가가 관찰되었으며, 300피코몰 인슐린에서 급격한 증가가 발생했습니다. 이 농도를 초과하면 인산화 수준이 정체되었고 인슐린이 감소한 후에도 내려가지 않았습니다. 정규화된 FRET 비율은 인슐린 자극 시 신호가 증가하고 인슐린 중단 시 기준선으로 돌아가지 않는 유사한 추세를 보였습니다.

순차적 인슐린 자극 시, 정규화된 FRET 비율의 점진적인 증가가 관찰되어 용량 의존적 Akt 활성화 반응을 뒷받침했습니다.