Name: HepG2 세포에서 대사적으로 조절되는 Akt 활성화 역학의 Live-Cell Förster Resonance Energy Transfer Imaging (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 배우세요 HepG2 세포에서 FRET 이미징을 활용한 Akt 활성화 역학 분석 방법. 이 실시간 프로토콜은 인슐린 신호전달과 대사 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>깁코</td><td>고양이 #25200-056</td><td>세포 세척에 얼음처럼 차가운 PBS 사용</td></tr><tr><td>15mm 유리 바닥 세포 배양 접시</td><td>둥지</td><td>고양이#801001</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; mL Nalgene 극저온 바이알</td><td>써모 사이언티픽</td><td>고양이#5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 스트라이프 혈청학적 피펫</td><td>코 닝</td><td>고양이#4487</td><td></td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td>케르멜</td><td>고양이#C028005</td><td></td></tr><tr><td>A1 HD25/A1R HD25 컨포칼 현미경</td><td>니콘</td><td>https://www.nikon.com/</td><td>배율 : 40 배, 개구수 (NA) : 1.30, 픽셀 체류 시간 : 2.4 ms, 픽셀 크기 : 1024</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마-알드리치</td><td>고양이 #A9393</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>VWR 생명 과학</td><td>고양이#N208-10g</td><td></td></tr><tr><td>코닝 25&nbsp; cm2 직사각형 배양 플라스크</td><td>코 닝</td><td>고양이#430639</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 자동 세포 계수기</td><td>써모 사이언티픽</td><td>http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>써모 사이언티픽</td><td>http://www.thermofisher.com/#C10228</td><td></td></tr><tr><td>디지털 와류 믹서</td><td>써모 사이언티픽</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>고양이#D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 세이프락 튜브 1.5&nbsp; 밀리얼</td><td>에펜도르프</td><td>고양이#022363204</td><td></td></tr><tr><td>EZ-PCR 마이코플라스마 검출 키트</td><td>생물 산업</td><td>고양이 # 20-700-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 적격, 호주</td><td>깁코</td><td>고양이#10099141</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 보충제</td><td>깁코</td><td>고양이#35050061</td><td></td></tr><tr><td>그래프패드 프리즘 9</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>헵G2</td><td>인증된 세포 배양의 국립 컬렉션</td><td>#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510&nbsp; http://www.cellbank.org.cn/</td><td></td></tr><tr><td>침지 오일 타입 37</td><td>카질 연구소</td><td>고양이 #16237</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치</td><td>고양이#I5500-50MG</td><td>37도 >.까지 따뜻함; 사용 전 C</td></tr><tr><td>LB 국물 (1x)</td><td>인비트로젠</td><td>고양이#10855001</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체(MEM)</td><td>깁코</td><td>고양이#11095080</td><td>37도 >.까지 따뜻함; 사용 전 C</td></tr><tr><td>마이스핀 12&nbsp; 미니 원심분리기</td><td>써모 사이언티픽</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>나노드롭 원</td><td>써모 사이언티픽</td><td>https://www.thermofisher.com</td><td></td></tr><tr><td>니콘 플랜 플루어 40&times;/1.30 오일 렌즈</td><td>니콘</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>NIS-요소-AR</td><td>니콘</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA)(100x)</td><td>깁코</td><td>고양이#11140050</td><td></td></tr><tr><td>원샷 LB 한천 플레이트&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>고양이 #A55802</td><td></td></tr><tr><td>원샷 Stbl3 화학적으로 유능한 E.&nbsp; 대장균</td><td>인비트로젠</td><td>고양이#C737303</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>파라필름</td><td>고양이#B8R05606</td><td></td></tr><tr><td>PBS(인산염 완충 식염수)</td><td>깁코</td><td>고양이#10010023</td><td></td></tr><tr><td>pEevee-iAkt-NES (7,033&nbsp; bp)</td><td>미우라 et&nbsp; al31</td><td>https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>깁코</td><td>고양이#15070063</td><td></td></tr><tr><td>플라스모신 예방</td><td>인비보젠</td><td>고양이#ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 브롬화수소&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>고양이#P4832</td><td></td></tr><tr><td>정밀 범용 수조</td><td>써모 사이언티픽</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 스핀 미니프렙 키트</td><td>키아겐</td><td>고양이#27106</td><td></td></tr><tr><td>스냅진</td><td>Dotmatics의 SnapGene</td><td>https://www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨(100mM)</td><td>깁코</td><td>고양이#11360070</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 장치, 0.22&nbsp; &무; m</td><td>밀리포어</td><td>고양이#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>도카이 히트 스테이지 탑 인큐베이터</td><td>도카이 히트</td><td>https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase가 없는 증류수</td><td>인비트로젠</td><td>고양이#10977015</td><td></td></tr><tr><td>Xfect 형질감염 시약</td><td>타카라 바이오</td><td>고양이#631317</td><td></td></tr></tbody></table>

hepg2 세포에서 대사적으로 조절되는 akt 활성화 역학의 live-cell förster resonance energy transfer imaging

Live-Cell F&#246;rster Resonance Energy Transfer Imaging of Metabolically Regulated Akt Activation Dynamics in HepG2 Cells

HepG2 세포의 Akt 활성화를 조사하기 위해 세포를 사전 코팅된 이미징 접시에 파종하고 Akt 인산화를 실시간으로 모니터링할 수 있도록 설계된 FRET 기반 바이오센서 pEevee-iAkt-NES(그림 2A)로 형질 주입했습니다. 형질주입 후, 세포는 대사 상태를 동기화하고 기저 인슐린 신호 전달을 최소화하기 위해 무혈청 배지에서 4시간 동안 혈청 결핍을 겪었습니다.
그 후 세포를 다양한 인슐린 농도(0 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 400 pM, 100 pM 및 0 pM)에 노출시켜 인슐린 신호 전달 경로를 체계적으로 활성화했습니다. 그림 10A에서 볼 수 있듯이, Akt 인산화의 용량 의존적 증가가 관찰되었습니다. 특히, 300 pM 인슐린에서 인산화의 급격한 증가가 발생하여 최대 Akt 활성화의 임계값을 표시했습니다. 이 농도를 넘어서면 인산화 ...

HepG2 세포에서 대사적으로 조절되는 Akt 활성화 역학의 Live-Cell Förster Resonance Energy Transfer Imaging

Metabolically regulated Akt activation is a critical node in the insulin signaling cascade and provides valuable insights into the relationship between ...

세포 이질성은 본질적으로 평균화된 세포 역학의 복잡성을 정확하게 설명하는 데 장애물이 됩니다. 이것이 우리가 단일 세포를 이미지화하기 위해 여기에 있는 이유입니다. 유전적으로 암호화된 FRET 바이오센서의 최근 개발은 특이성을 향상시켰고 세포 내 Akt의 실시간 추적에 혁명을 일으켰으며, 이는 이종유전을 이해하고 맞춤형 약물 요법을 개발하는 데 중요한 역할을 합니다.암과 당뇨병은 복잡한 대사 경로를 통해 발생합니다. 암에서 인슐린 신호 전달 경로의 생체 복합체를 해독하기 위해 단일 세포 해상도에서 최첨단 생세포 FRET 이미징을 사용합니다. 우리는 레이저 출력을 미세 조정하고 검출기 이득을 조정하는 것과 함께 공초점 현미경, 하드웨어 및 소프트웨어 구성을 최적화하는 것이 FRET 신호의 노이즈 및 스펙트럼 누화를 최소화하는 데 중요하다는 것을 발견했습니다.웨스턴 블로팅과 같은 전통적인 벌크 방법은 공간적 시간적 세부 사항이 부족하고 세포 이질성을 가립니다. 우리의 프로토콜은 살아있는 세포 FRET 이미징을 사용하여 높은 정밀도와 정확도로 세포 반응을 포착함으로써 이러한 격차를 메웁니다. 시작하려면 1밀리리터당 0.1밀리그램의 폴리-L-라이신 용액을 이미징 접시에 넣고 접시를 흔들어 전체 표면을 덮습니다.하룻밤 배양 후 접시에서 과도한 폴리-L-라이신 용액을 흡인합니다. PBS로 표면을 3회 부드럽게 헹구고 각각 5분 동안 휴지시켜 결합되지 않은 폴리-L-라이신을 완전히 제거합니다. PBS를 흡인하고 코팅된 이미징 접시를 섭씨 37도에서 최소 3시간 동안 자연 건조시킵니다.다음으로, 형질감염 24-48시간 전에 사전 코팅된 이미징 접시에 HepG2 세포를 시딩하여 70-90% 합류에 도달하도록 합니다. Forster Resonance Energy Transfer 바이오센서를 암호화하는 플라스미드와 함께 형질감염 시약을 해동하고 소용돌이치게 합니다. 짧은 회전을 수행하여 튜브 바닥에 있는 모든 혼합물을 수집합니다.8마이크로그램의 플라스미드를 반응 완충액과 혼합하여 고속으로 5초 동안 와류를 사용하여 최종 부피 100마이크로리터가 됩니다. 튜브 바닥에 혼합물을 모으기 위해 짧게 회전합니다. 희석된 혈장 DNA가 들어 있는 튜브에 2.4마이크로리터의 형질감염 폴리머를 넣고 잘 혼합합니다.바이오센서와 폴리머 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 나노입자 복합체가 형성되도록 합니다. 튜브를 5, 000G에서 5초 동안 회전시켜 바닥에 내용물을 모으십시오. 전체 100마이크로리터의 나노입자 복합체 용액을 세포 배양 배지에 적가하고 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 혼합합니다.플레이트를 섭씨 37도에서 4시간에서 밤새 배양합니다. 세포에서 나노입자 복합체를 제거한 후 용액을 2밀리리터의 신선한 완전 성장 배지로 교체합니다. 분석 시간까지 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터로 되돌립니다.형광 현미경으로 세포를 분석합니다. 이미징 접시에서 배양 배지를 제거하고 접시를 1X PBS로 두 번 헹구고 각 헹굼이 5분 동안 지속되도록 합니다. 접시 가장자리 주위의 각 접시에 2밀리리터의 기아 배지를 추가합니다.세포를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 컴퓨터를 켠 다음 공초점 현미경 본체와 액세서리의 전원을 순차적으로 켭니다. 그런 다음 키를 켜짐 위치로 돌리고 레이저 발사 토글 스위치를 켜서 레이저 시스템을 활성화합니다.그런 다음 레이저 잠금 스위치를 시계 방향으로 돌려 두 레이저 라인의 켜짐 위치로 돌립니다. 마지막으로 시스템 컨트롤러 전원을 켭니다. 데스크탑에서 NIS-Elements AR 소프트웨어를 실행합니다.획득을 위해 A1을 클릭하여 이미징 설정을 시작하고 실험 요구 사항에 따라 적절한 광학 구성을 선택합니다. 현미경 무대 상단 인큐베이터를 설치하고 나사로 고정합니다. 내부 수조를 멸균된 이중 증류수로 채웁니다.그런 다음 상단 히터를 설치하고 스테이지 히터, 목욕 히터, 렌즈 히터의 전원을 켭니다. 40% 에탄올을 적신 렌즈 페이퍼로 95X 오일 이멀젼 렌즈를 닦고 대물 렌즈에 작은 이멀젼 오일 방울을 올려 놓습니다. 그런 다음 HepG2 세포가 들어 있는 이미징 접시를 현미경 스테이지에 놓고 홀더로 고정합니다.챔버를 닫고 평형을 위해 세포를 1-2시간 동안 배양합니다. NIS-Elements AR의 파일 메뉴에서 ND 획득 창을 시작합니다. 시간 탭을 선택하여 타임랩스 이미징의 간격, 지속 시간 및 루프를 설정합니다. XY 탭을 클릭하고 추가 버튼을 눌러 초점 이미징을 위한 HepG2 세포를 포함합니다.그런 다음 Z 상자를 선택하여 Z 위치를 설정합니다. 찾아보기를 클릭하여 대상 폴더를 선택합니다. 파일 이름 상자에 실험 이름을 입력합니다.지금 실행을 클릭하여 획득을 시작하고 타임랩스 이미징 프로세스를 시작합니다. 인슐린 보충 배지 없이 최대 30분 동안 기본 측정값을 기록합니다. 정기적으로 이미징을 일시 중지합니다.유리 바닥 접시에서 배지를 부드럽게 제거하고 적절한 인슐린 농도가 보충된 배지 1밀리리터를 추가합니다. 이미지 획득을 다시 시작하고 실험이 끝날 때 마침을 클릭하여 닫습니다. 마지막으로, 분석을 위해 획득한 이미지를 백업하고 안전하게 저장합니다.인슐린 자극 시 Akt 인산화의 용량 의존적 증가가 관찰되었으며, 300피코몰 인슐린에서 급격한 증가가 발생했습니다. 이 농도를 초과하면 인산화 수준이 정체되었고 인슐린이 감소한 후에도 내려가지 않았습니다. 정규화된 FRET 비율은 인슐린 자극 시 신호가 증가하고 인슐린 중단 시 기준선으로 돌아가지 않는 유사한 추세를 보였습니다.순차적 인슐린 자극 시, 정규화된 FRET 비율의 점진적인 증가가 관찰되어 용량 의존적 Akt 활성화 반응을 뒷받침했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

MRP4는 세포 이동에 최근에 밝혀 역할 등 다양한 주기적 뉴클레오티드 종속 신호 이벤트를 조절한다. 우리는 섬유 아세포 이전의 미세 조정 조절에 중요​​한 역할을 고유 MRP4의 상호 작용 체의 식별 결과 MRP4의 하류 분자 표적을 해명하기 위해 직접하지만, 다각적 인 접근 방법을 설명합니다.

방법은 섬유 아세포 마이그레이션의 규정에 Mrp4 함유 Macromolecular의 단지를 공부하기

여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

단단히 초점을 맞춘 펨토초 레이저는 공초점 현미경 검사법에 결합되어 세포에 정확한 자극을 전달하여 실시간 관찰 및 광자극을 가능하게 합니다. 광자극은 ERK 신호 통로 및 반응성 산소 종의 미토콘드리아 섬광을 포함한 세포 분자 이벤트를 활성화할 수 있습니다.

펨토초 레이저에 의한 광자극은 대상 세포에서 세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 신호 또는 미토콘드리아 이벤트를 활성화합니다.

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

시간-분해된 Förster 공명 에너지 전달 세포 기반 분석 프로토콜은 384-웰 포맷의 세포 용해물에서 내인성 인산화 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT) 1/3/4/5/6 단백질의 단순하고, 특이적이며, 민감하고, 강력한 정량화를 위해 기술된다.

인간 세포에서 내인성 인산화 STAT 단백질의 측정을 위한 시간 분해된 Förster 공명 에너지 전달 분석

실시간 세포 대사 플럭스 분석은 pH 및 산소 센서를 사용하여 미토콘드리아 및 글리콜 아데노신 삼인산염 생산에 해당하는 산소 소모율 및 세포외 산성화 속도를 측정합니다. 원고는 조골 세포의 에너지 상태와 세포 생물 에너지 상태의 특성화 및 해석을 이해하는 방법을 설명합니다.

실시간 세포 대사 플럭스 분석기를 사용하여 조골세포 생물에너지 모니터링

이 프로토콜은 내인성 대사 조효소, 환원된 니코틴아미드 아데닌(인산염) 디뉴클레오타이드(NAD(P)H) 및 산화된 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)의 형광 이미징 및 분석을 기술한다. NAD(P)H 및 FAD의 자가형광 이미징은 세포 대사를 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴적인 방법을 제공한다.

세포 대사를 평가하기 위한 자가형광 이미징

우리는 이광자 여기 형광 현미경(2PEF)과 통합된 산화중수소(중수D2O) 탐침 자극 라만 산란(DO-SRS) 현미경을 사용하여 아미노산에 의해 조절되는 세포에서 대사 활동을 직접 시각화하는 프로토콜을 제시합니다.

방향족 아미노산에 의해 조절되는 세포 대사의 생체 직교 화학 이미징

이 프로토콜은 맞춤형 생물반응기 시스템을 과분극 ¹³C NMR 분광법과 통합하여 살아있는 세포의 실시간 피루브산 대사를 측정함으로써 대사 연구 및 약물 스크리닝 응용 분야의 재현성과 운동 정확도를 개선합니다.

과분극 13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

배우세요 HepG2 세포에서 FRET 이미징을 활용한 Akt 활성화 역학 분석 방법. 이 실시간 프로토콜은 인슐린 신호전달과 대사 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

HepG2 세포에서 대사적으로 조절되는 Akt 활성화 역학의 Live-Cell Förster Resonance Energy Transfer Imaging

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