선택된 조직 영역을 사용하는 질량 분석 기반 단백질체학을 위한 간소화된 접근법

우리는 질량 분석법을 사용하여 고등 조직 샘플의 특정 영역에서 단백질체를 연구하기 위한 간소화된 방법을 개발했습니다. 당사의 목표는 시료 전처리 및 질량 분석 분석을 포함한 단백질체학 기술을 향상시켜 높은 정확도와 신뢰성을 달성하는 것입니다. FFPE 기반 공간 단백질체학의 한 가지 과제는 불완전한 단백질 소화로 인해 전체 단백질 커버리지가 감소한다는 것입니다.

이를 극복하기 위해서는 최적화된 분해 프로토콜과 향상된 질량 분석 전략이 필요하며, 이를 통해 단백질체 깊이와 정확도를 개선해야 합니다. 우리는 다양한 유형의 췌장 질환에서 뚜렷한 단백질 변화를 확인하여 양성 상태와 전암성 상태의 차이점에 대한 통찰력을 제공했습니다. 이러한 발견은 췌장암의 조기 진단에 도움이 될 수 있습니다.

우리는 조직 영역 내에서 고해상도 단백질 매핑을 달성하기 위해 환자 단백질 분해 효소 방법을 발전시키는 것을 목표로 합니다. 질량 분석 기반 단백질체학을 활용하여 바이오마커 발견에 기여하는 영역별 분자 서명을 식별하려고 합니다. 당사의 접근 방식은 이러한 환자 포획 및 사전 준비를 데이터 독립적인 경우(occasion) 질량 분석법과 통합하여 선택한 FFPE 조직 영역에서 고품질 단백질체 데이터를 신속하게 생성합니다.

이 방법을 사용하면 공간 단백질체를 크게 정량화할 수 있습니다. 먼저 병리학자가 표시한 관심 영역을 사용하여 헤마톡실린 및 에오신 염색 또는 면역조직화학적으로 염색된 조직 슬라이드를 준비합니다. 염색되지 않은 조직 슬라이드와 염색된 조직 슬라이드를 차례로 놓고 적절한 정렬을 보장합니다.

메스를 사용하여 관심 없는 조직 영역을 제거하고 슬라이드 중앙을 향해 관심 조직 영역을 긁어냅니다. 수집된 조직을 깨끗한 1.5ml 저단백질 결합 튜브로 옮기고 각 튜브에 180마이크로리터의 SDS 용해 완충액을 추가합니다. 20% 진폭에서 5초 동안 켜고 5초 동안 끄는 10주기 동안 프로브 초음파 처리를 수행합니다.

지금, 1의 속도를 유지하고 있는 동안 3.5 시간 동안 100 섭씨 온도에 표본을 배양하십시오, 외피 000 G.After 표본은 10 분 동안 실내 온도에 냉각하는 것을 허용하십시오. 그런 다음 16, 000G에서 실온에서 10분 동안 원심분리하여 상층액에서 조직 파편을 분리합니다. 라벨이 붙은 깨끗한 튜브에 상층액을 모으고 나중에 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

아세톤 침전을 위해 100-300마이크로그램에 해당하는 단백질 샘플을 아세톤 호환 튜브에 넣습니다. 그런 다음 섭씨 영하 20도로 미리 냉각된 얼음처럼 차가운 아세톤을 샘플 부피의 5배 부피에 추가합니다. 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 18시간 동안 배양합니다.

배양 후에, 16, 000 G에 15 분 동안 관을 원심분리하십시오. 단백질 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 폐기하십시오. 섭씨 영하 20도에서 템퍼링된 아세톤 500마이크로리터와 원심분리기를 추가합니다.

상층액을 디캔팅한 후 샘플을 자연 건조시킵니다. 탈이온수에 현탁액 트래핑 용해 완충액을 준비합니다. 그런 다음 준비된 완충액 40마이크로리터를 샘플 튜브에 넣고 완전히 와류하여 공기 건조된 단백질 펠릿을 용해시킵니다.

샘플을 섭씨 100도, 1, 000G의 진탕 인큐베이터에 35분 동안 넣습니다. 다음으로, 10마이크로리터의 알킬화 시약을 샘플에 추가하고 샘플을 300G의 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 화학 흄 후드 내부에 10%트리클로로아세트산 5마이크로리터를 샘플에 추가하여 총 부피를 55마이크로리터로 만듭니다.

pH를 확인하십시오.amppH 종이를 사용하여 1 미만인지 확인합니다. 다음으로, 350마이크로리터의 결합 완충액 1을 샘플에 추가하여 단백질을 트랩합니다. 현탁액 트래핑 컬럼을 2ml 튜브에 넣고 불용성 물질을 포함한 전체 샘플을 컬럼으로 옮깁니다.

4, 000G에서 50초 동안 컬럼을 원심분리하여 단백질을 트랩합니다. 그런 다음 400마이크로리터의 세척 버퍼 2를 추가합니다. 원심분리 후 플로우스루를 폐기하십시오.

최종 세척 후 4, 000G에서 1.25분 동안 컬럼을 원심분리하여 버퍼 1이 완전히 통과하도록 합니다. 125마이크로리터의 분해 완충액을 현탁액 트래핑 컬럼에 추가하고 증발을 방지하기 위해 캡을 씌웁니다. 흔들지 않고 섭씨 37도에서 18시간 동안 샘플을 배양합니다.

이제 80마이크로리터의 용리 완충액을 현탁액 트래핑 컬럼에 추가하고 4, 000G에서 1.25분 동안 원심분리합니다. 용출된 펩타이드를 당겨 깨끗한 새 튜브로 옮깁니다. 펩타이드 정량 분석 후 20마이크로그램의 펩타이드를 동결건조합니다.

동결건조된 펩타이드를 0.1% 포름산수에 3%아세토니트릴을 함유한 40마이크로리터의 수성 완충액에 다시 용해시키고 초음파 수조에서 10분 동안 초음파 처리합니다. 16, 000 G에서 60 분 동안 샘플을 원심 분리하고 질량 분석 분석을 위해 상등액을 바이알로 옮깁니다. 나노 액체 크로마토그래피 질량 분석기 시스템의 자동 시료 주입기를 사용하여 각 시료를 2마이크로리터씩 주입합니다.

분당 100나노리터에서 5-35%아세토니트릴의 127분 그래디언트를 사용하여 3마이크로미터 C18 물질로 충전된 역상 컬럼에서 펩타이드를 분리합니다. 나노스프레이 이온 소스를 통해 펩타이드를 이온화하고 Orbitrap 기반 질량분석기로 전달합니다. 협대역 데이터 독립적 수집 방법을 사용하여 펩타이드를 분석합니다.

FFPE 조직 처리 중 정확한 관심 영역 분리는 다양한 췌장 낭성 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 달성되었습니다. 재현 가능한 총 이온 크로마토그램은 각 유형의 췌장 낭성 신생물에 대한 생물학적 트라이플리크(tricoprecis) 간에 얻어졌습니다. 액체 크로마토그래피 질량 분석 분석은 9,703개의 단백질을 식별했습니다.

확인된 모든 단백질의 함량은 6.25배에 달하여 포괄적인 단백질체 적용 범위를 보여주었으며 알려진 췌장암 단백질 마커를 정량화했습니다. 총 933개의 차등적으로 발현된 단백질이 확인되었으며, 457개는 상향 조절되고 476개는 관내 유두 점액 신생물에서 하향 조절되었습니다. 생물정보학 분석은 차등적으로 발현된 단백질이 여러 췌장암 관련 경로와 관련이 있음을 밝혔습니다.