Fragile X Messenger Ribonucleoprotein이 결핍된 인간 유도 만능 줄기세포 유래 성상세포의 생성 및 특성화

이 연구는 4개의 뇌 특이적 인간 성상세포와 취약 X 증후군과 같은 신경 발달 장애에 의해 어떻게 변경되는지에 초점을 맞춥니다. 이전 연구에서는 동물 모델을 사용하여 주로 뉴런을 연구했기 때문에 이 연구는 이 연구 분야에 새로운 차원을 추가합니다.

동물 연구에서 얻은 기계론적 통찰력은 제한적인 임상 성공을 거두었습니다. 가장 큰 과제는 인간 기원의 뉴런과 성상세포에 대한 유사한 통찰력을 얻는 것입니다.

우리의 프로토콜은 취약 X 증후군에서 조절 장애, 해당작용 및 미토콘드리아 대사를 나타내는 바람 특이적 성상세포에 대한 기능을 성공적으로 생성하여 질병 생물학에서 신경교세포의 역할에 대한 조사를 가능하게 했습니다. 건강과 질병의 신경 기능에서 신경교세포의 핵심 역할에 대한 증거가 증가하고 있음에도 불구하고 인간 성상세포가 취약 X 증후군과 같은 신경 발달 장애에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

앞으로 우리는 이 프레임워크를 바탕으로 성상세포와 뉴런과의 상호 작용이 질병에 의해 어떻게 변경되는지, 그리고 이를 치료 개입으로 어떻게 교정할 수 있는지 연구할 것입니다.

[강사] 시작하려면 고급 DMMF 12에서 1:60의 비율로 희석된 마트리겔로 6번 팽창 접시를 코팅합니다. 코팅된 접시를 섭씨 2도에서 8도의 온도에서 보관하십시오. 배양 당일, 접시에서 코팅 재료를 제거하고 최종 농도 1X의 암석 억제제와 함께 완전한 필수 8 배지 1밀리리터를 추가합니다. 접시를 인큐베이터 안에 넣습니다. 인간 유도만능줄기세포(IPSC)를 추가하기 전에 5% 이산화탄소로 섭씨 37도로 설정합니다. 콜로니 부착을 강화하기 위해 암석 억제제가 포함된 완전한 필수 8 배지에 최종 농도 1X로 인간 IPSC를 파종합니다. 다음날, 완전한 필수 8 배지를 암석 억제제가 없는 신선한 배지로 교체하십시오. 세포가 80% 합류에 도달할 때까지 매일 배지를 계속 보충하며, 이 경우 약 4-5일이 소요됩니다. 콜로니가 80% 합류에 도달하면 콜라게나제 및 분산 효소의 혼합물을 첨가하여 접시에서 효소적으로 분리합니다. 콜로니가 들어 올리기 시작하면 인큐베이터에서 접시를 꺼내 효소 활성을 중화시키기 위해 DPBS 2밀리리터를 추가합니다. DPBS를 사용하여 콜로니를 긁어내고 넓은 보드 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 수집합니다. 그런 다음 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 현탁액을 2-3회 부드럽게 분쇄하여 콜로니를 분해합니다. 식민지가 정착하도록 허용하십시오. 약 2분 후, 튜브에 약 1밀리리터의 액체를 남기면서 DPBS 효소 혼합물을 흡인합니다. 그런 다음 2밀리리터의 DPBS를 튜브에 넣고 부드럽게 두드려 혼합하여 콜로니를 다시 현탁시킵니다. 가라앉히고 이 과정을 두 번 반복하여 잔류 효소를 제거합니다. 상청액을 제거한 후, 콜로니를 1밀리리터의 완전한 필수 8개 배지에 다시 현탁시키고 새로 준비된 마트리겔 코팅 접시에 접시합니다. 앞서 설명한 바와 같이 인간 유도 만능 줄기 세포를 효소적으로 들어 올린다. 화학적으로 정의된 배지가 있는 비부착성 100mm 현탁액 배양 접시에 도금합니다. 세포 현탁액을 정상 산소 조건에서 7일 동안 분당 40회전으로 안와 셰이커에 놓아 피질 구체의 발달을 촉진합니다. 8일째에 코르티코 구체를 세포 증식 배지로 옮기고 7일 동안 유지합니다. 신경교 사양을 유도하기 위해 코르티코 구체를 신경교 농축 배지에서 2주 동안 배양하여 초기 신경교 구를 얻습니다. 초기 신경아교세포의 성숙을 위해 염기성 섬유아세포 성장 인자 H를 백혈병 억제 인자 밀리리터당 20나노그램으로 대체하고 4주 동안 구체를 유지합니다.

성숙 배지에서 4주 후, 장기간 동안 신경교 농축 배지에서 구체를 계속 유지합니다. 응집 및 생존력 손실을 방지하려면 멸균 산업용 블레이드를 사용하여 2주마다 신경교 구체를 기계적으로 자릅니다. 전체 배지를 DNase 1로 교체하여 절단에서 생성된 DNA 단편을 제거합니다. 다음으로, 파파인 해리 키트를 사용하여 아교세포 구체를 성상세포 전구 세포의 단층으로 분리합니다. 해리된 세포를 세포 배양물에 도금하고, 1 내지 80 희석액으로 마트리겔로 사전 코팅된 부착 접시를 처리합니다. 성상세포 전구세포가 80% 컨플루언트에 도달할 때까지 신경교 농축 배지에서 증식합니다. 통과 세포는 사용한 배지를 제거하고 원추형 튜브에 수집합니다. 효소 세포 박리 배지를 세포에 넣고 1-2분 동안 기다립니다. 세포가 분리되기 시작하면 사용한 배지를 첨가하여 효소 활성을 중화합니다. 세포 현탁액을 수집하고 800G에서 2분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 세포를 신경교 농축 배지에 다시 현탁합니다. 웰당 6셀의 거듭제곱으로 약 10 배 10을 1 내지 80 희석으로 마트리겔 코팅 접시에 도금합니다. 냉동 보존을 위해 세포 펠릿을 90% 코르티코 구체 증식 배지와 10% 냉동 보호제의 차가운 혼합물에 재현탁합니다. 재현탁된 세포를 크라이오 바이알로 옮깁니다. 즉시 냉동 바이알을 냉동 상자에 옮기고 밤새 섭씨 영하 80도의 냉동실에 보관합니다. 다음날 장기 보관을 위해 모든 극저온 바이알을 액체 질소 탱크로 옮깁니다. Vimenton 및 핵 인자 IAM 마커로 면역 염색을 통해 해리된 성상세포 전구 세포를 특성화합니다. 인간 IPSC 유래 APC의 4개 뇌 지역 특이성을 확인하기 위해 인간 포크 헤드 박스 G1 및 인간 호메오 박스 B4에 대한 실시간 QPCR 분석을 수행합니다. APC를 성상세포와 성상세포 분화 배지로 14일 동안 분화합니다. 35mm 유리 바닥 접시에 성상세포를 접시당 3개의 세포의 5배10제곱의 밀도로 플레이트하여 아데노신 5 삼인산염에 대한 반응을 측정합니다. 세포가 24시간 동안 유리 바닥에 부착되도록 합니다. 칼슘이 없는 Hank's Balanced Salt Solution으로 부착된 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 5마이크로몰 비율 메트릭 이우레이드를 2:00 AM 및 0.02% 플루로닉 F127을 포함하는 배양 배지에서 실온에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 배지로 세포를 두 번 세척한 후 배지를 Hank's Balanced Salt 용액이 함유된 2밀리몰 칼슘으로 교체합니다. 초점 드리프트 보상 도립 현미경에서 60X 오일 침지 대물렌즈를 사용하여 초당 2프레임으로 세포를 이미지화합니다. 마지막으로, 25초 표시에서 최종 농도 5밀리몰로 ATP를 첨가한 후 ATP 유도 칼슘 반응을 기록합니다. 인간 IPSC 콜로니는 면역 염색에 의해 확인된 바와 같이 만능 마커 옵션 4 및 나노를 발현했습니다. 취약 X 증후군에서 파생된 APC와 대조군은 비슷한 비율의 비멘틴과 NFIA 양성 세포를 보였습니다. 대조군 및 취약 X 증후군 인간 유도 만능 줄기 세포의 성상세포 전구 세포는 HOXB4에 비해 Fox G1의 상향 조절을 나타내며 전뇌 정체성을 나타냅니다. 인간 IPSC 취약 X 증후군 계통에서 유래한 성상세포는 GFAP 발현 수가 감소한 것으로 나타났습니다. 대조군 및 취약 X 증후군 성상세포는 ATP 유도 칼슘 일시성을 나타냈지만 취약 X 증후군 성상세포에서는 반응자 수가 유의하게 낮았습니다. 첫 번째 ATP 유발 칼슘 과도 상태의 피크 진폭은 대조군 세포에 비해 취약 X 증후군 성상세포에서 유의하게 낮았습니다. 인간 IPSC 유래 취약 X 증후군 성상세포는 해당작용, 해당작용 능력 및 해당작용 예비력의 증가를 보였지만 대조군 성상세포에 비해 최대 호흡의 유의한 감소를 보였습니다.