Name: Plasmid DNA Transfection 및 mRNA Nucleofection Delivery를 사용한 인간 세포의 CRISPR 에피게놈 편집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 학습하세요 인간 세포에서 CRISPR 기반 에피게놈 편집을 위한 플라스미드 DNA 트랜스펙션과 mRNA 뉴클레오펙션 방법. dCas9에 크로마틴 이펙터를 융합하여 DNA 절단 없이 유전자 발현을 조절하는 기술입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리 몸에 있는 모든 세포의 게놈 함량은 거의 동일하지만 각 세포 유형의 전사 프로필은 크게 다릅니다. DNA와 히스톤 단백질에 대한 후성유전학적 변형은 전사 발현의 핵심 조절자입니다. 전사 활성 유크로마틴(Euchromatin)은 조밀하고 전사 비활성 헤테로크로마틴(heterochromatin)에 비해 뚜렷한 후성유전학적 표시(epigenetic marks)로 특징지어집니다. 예를 들어, 이색성 영역은 히스톤 3 (H3K9me3)의 라이신 9에 대한 트리메틸화, 히스톤 H3 (H3K27me3)의 라이신 27에 대한 트리메틸화, 유전자 프로모터1에서 구아닌(CpG) 옆의 시토신에 대한 DNA 메틸화를 포함한 억압적 히스톤 변형에 의해 정의됩니다. 활성 유전자 발현의 게놈 영역은 일반적으로 히스톤 3 (H3K4me3) 1의 라이신 4에 대한 히스톤 아세틸화 및 트리메틸화에 의해 정의됩니다.
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 혁명은 게놈 염기서열의 프로그래밍된 변경을 가능하게 하는 풍부한 도구를 생성했습니다. CRISPR 기술은 프로그래밍 가능한 표적 염기서열에서 핵산을 절단할 수 있는 원핵 방어 메커니즘을 기반으로 합니다. CRISPR nuclease 2,3,4, base editors 5,6 및 prime editors 7,8은 DNA 절단 및 이러한 절단의 복구를 통해 포유류 게놈의 DNA 염기서열을 변경할 수 있습니다. 이러한 전략은 효과적이기는 하지만, off-target site에서 DNA 파괴 9,10 및 대규모 게놈 구조 돌연변이 11,12,13,14,15를 유발할 수 있습니다. 대체 CRISPR 기반 도구를 사용하면 기본 DNA 염기서열을 변경하지 않고도 유전자 활성화 및 억제를 다루기 쉽게 조절할 수 있습니다. 이러한 도구는 뉴클레아제 결핍 Cas9(dCas9)를 활용하여 염색질 풍경을 변경하는 효과기 단백질과 함께 sgRNA 서열에 의해 지시된 표적 부위에서 DNA 결합을 허용합니다 16,17,18. 후성유전학적 작성자(epigenetic writer), 판독기(reader) 및 지우개(eraser)와 같은 효과기 단백질은 dCas9에 직접 융합되거나 SunTag와 같은 dCas9에 융합된 펩타이드 골격 또는 MS2-MCP 시스템과 같은 sgRNA의 RNA 골격에 의해 모집될 수 있습니다 16,17,18. 프로그래밍 가능한 전사 제어 도구의 예로는 CRISPR 활성화(CRISPRa)19,20,21 및 CRISPR 간섭(CRISPRi)22,23이 있습니다. CRISPRa는 전사 기전을 직접 모집하여 표적 전사 유전자 발현을 증가시킴으로써 작용합니다19. 대조적으로, CRISPRi는 억압적 후성유전학적 표지인 H3K9me3를 확립하여 전사를 억제합니다22.
후성유전체 편집의 발전으로 과학 분야 전반에 걸쳐 이러한 도구를 광범위하게 사용할 수 있게 되었습니다. 서로 다른 effector 도메인과 단백질의 융합은 사용 가능한 후성유전체 편집기 툴킷을 확장했습니다 18,24,25,26,27,28,29,30. 또한 후성유전학적 변형 31,32,33,34,35,36, 효과기37,38,39 및 효과기 돌연변이 28,40,41의 역할을 해독하기 위해 후성유전체 편집기를 사용합니다 유전자 조절에서. 구체적으로, CRISPRi 및 CRISPRa는 세포 생존 42 및 세포 운명 43,44,45,46,47을 포함한 다양한 생물학적 과정을 위한 기능적 유전체학 스크리닝에 사용됩니다. 또한, 후성유전체 편집은 체외세포 공학 및 체내 치료에 대한 치료 잠재력을 가지고 있다18.
여기에서는 인간 세포주에서 프로그래밍 가능한 전사 억제를 위해 두 가지 dCas9 기반 후성유전체 편집기인 CRISPRi22 및 CRISPRoff48을 적용하는 방법에 대해 설명합니다. CRISPRi는 ZNF10 (KOX1) 및 ZIM322,23과 같은 아연 손가락 단백질에서 억제 KRAB 도메인으로 dCas9를 융합한 것입니다. CRISPRi가 특정 유전자 프로모터를 표적으로 삼을 때, KRAB 도메인은 H3K9me3 전달자인 SETDB1을 모집하여 표적 유전자를 억제합니다(그림 1A). CRISPRi가 일시적으로 발현되면 타겟 유전자 자리에서 확립된 H3K9me3가 유지되지 않고 시간이 지남에 따라 유전자 발현이 복원됩니다32,48. 기능적 유전체학 응용 분야와 같이 CRISPRi를 사용하여 안정적인 knockdown을 수행하기 위해서는 sgRNA와 함께 세포에서 CRISPRi의 구성적 발현이 필수적입니다. 최근 CRISPRoff는 유전 가능한 후성유전체 편집을 프로그래밍하도록 설계되었습니다48. CRISPRoff는 dCas9와 KRAB 도메인 및 de novo DNA 메틸전이효소 복합체, DNMT3A 및 DNMT3L의 단일 단백질 융합체입니다. 인간 세포에서 CRISPRoff의 일시적인 펄스는 표적 유전자에서 H3K9me3 및 DNA 메틸화의 증착을 프로그래밍하며, 이는 DNA 메틸화 및 H3K9me3의 유지에 의해 표적 유전자의 장기 억제로 이어집니다(그림 1B)48. 또한 후성유전체 편집을 되돌릴 수 있습니다. 예를 들어, CRISPRoff에 의해 안정적으로 침묵된 유전자는 TET1-dCas9에 의해 재활성화될 수 있으며, 이는 표적 유전자좌49에서 DNA 메틸화 마크를 효소로 제거할 수 있습니다.
이 프로토콜은 후성유전체 편집기의 일시적 발현을 위한 두 가지 전달 방법, 즉 플라스미드 DNA transfection과 mRNA nucleofection에 대해 자세히 설명합니다. 또한 유세포 분석을 사용하여 두 개의 내인성 유전자인 CLTA 및 CD55에서 후성유전체 편집 효능을 평가하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이러한 방법은 추가 편집기를 사용하여 다른 후성유전체 편집 실험에 적용 및 적용하거나 다른 유전자를 표적으로 하는 데 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68089/68089fig01.jpg"> 
그림 1: CRISPRi 및 CRISPRoff 후성유전체 편집 메커니즘 및 워크플로우의 개략도. (A) sgRNA 전이유전자 및 CRISPRi 후성유전체 편집기의 선형 회로도. CRISPRi와 sgRNA를 추가하면 억제적 H3K9me3 히스톤 마크를 추가하여 표적 위치를 침묵시킬 수 있습니다. CRISPRi 첨가 후 가장 높은 수준의 침묵(silencing)이 조기에 이루어지며, 유전자 표적은 일반적으로 몇 번의 계대 후에 재활성화됩니다. (B) sgRNA 전이유전자 및 CRISPRoff 후성유전체 편집기의 선형 회로도. 관심 유전자를 표적으로 하는 세포에 CRISPRoff를 추가하면 CpG 부위에서 DNA 메틸화와 함께 억제성 H3K9me3가 추가되어 표적 유전자를 침묵시킵니다. CRISPRoff에 의한 침묵(silencing)은 유전 가능하며, 높은 수준의 침묵(silencing)은 transfection 중 초기에 달성되며 여러 세포 분열에 걸쳐 지속됩니다. (C) transfection 방법을 통한 후성유전체 편집을 위한 타임라인 개요. 0일차에는 transfection을 위해 세포를 도말합니다. 1일차에는 editor와 guide plasmid를 transfection을 통해 세포에 도입할 수 있습니다. 3일차에는 유세포분석을 통해 세포의 BFP 발현을 평가합니다. BFP의 비율은 각 조건에 대한 실험의 최종 침묵 효능을 결정하기 위한 정규화 계수로 사용됩니다. 6일차부터는 이 날에 가장 높은 수준의 침묵이 달성될 것이므로 관심 보고자를 침묵시키기 위해 세포를 분석합니다. (D) 후성유전체 편집기 및 sgRNA 플라스미드를 적하 방식으로 세포에 첨가하는 형질주입 방법 개요. (E) 핵 절제 방법을 통한 후성유전체 편집을 위한 타임라인 개요. 이 프로토콜에서 mRNA는 0일차에 세포로 핵 절제입니다. 세포는 유세포 분석을 사용하여 핵 절제 후 3일째에 침묵을 평가합니다. (F) 핵 절제 프로토콜의 개요. 적절한 양의 세포와 mRNA를 혼합하여 핵펙터 큐벳에 첨가합니다. sgRNA가 nucleofection에 의해 도입되는 경우, 이 혼합물에 첨가될 수도 있습니다. 큐벳을 핵세포에 넣고 적절한 펄스 코드를 사용하여 mRNA를 세포에 도입합니다. 뉴클레오펙션(nucleofection) 후, 세포는 나중에 분석을 위해 도말화되고 계대분석됩니다. (G) 후성유전체 편집을 위한 플라스미드 형질주입과 mRNA 핵융합 전략의 비교. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68089/68089fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 조직 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 U-바닥 플레이트</td><td>Corning</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-human cd55 항체</td><td>BioLegend</td><td>311312</td><td></td></tr><tr><td>BD FAC심포니 A1 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>왁시</td><td></td><td></td>11003428432</tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Scientific</td><td>Countess 3</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRoff transfection plasmid</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>167981</tr><tr><td>희석제 2 유세포 분석용 혈액학 시약(칼집 유체)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-029-361</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Thermo Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M35</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>론자 워커스빌&nbsp; SF 세포주 4D-Nucleofector X Kit L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0281111</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE&trade; T7 ULTRA 전사 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco 31985070</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 스트립 튜브</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신-글루타민</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>pLG1 sgRNA 발현 플라스미드</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>217306</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22-400-105</td><td></td></tr><tr><td>SF 세포주 96-웰 핵세포주&reg; &nbsp; Kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUVDL-PA</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI 트랜스펙션 시약</td><td>Mirus</td><td>MIR 2306</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr></tbody></table>

plasmid dna transfection 및 mrna nucleofection delivery를 사용한 인간 세포의 crispr 에피게놈 편집

CRISPR Epigenome Editing in Human Cells using Plasmid DNA Transfection and mRNA Nucleofection Delivery

모든 후성유전체 편집 실험에서 적절한 대조군은 후성유전체 편집 효율성을 평가하는 데 중요합니다. 인간 게놈의 염기서열을 표적으로 하지 않는 대조군 sgRNA를 사용하는 것이 좋습니다. 비표적 가이드 대조군을 사용하면 표적 유전자 자리의 변화가 후성유전체 편집기, 과발현 또는 비특이적 결합이 아니라 해당 부위로 유도되는 후성유전체 편집기에 의해 주도된다는 확신을 가질 수 있습니다. 또한 리포터 유전자 기반 실험의 경우 dCas9 단독 대조군을 사용하여 리포터 발현의 변화가 dCas9이 타겟 자리에 결합하는 입체 방해가 아닌 후성유전체 편집기 융합으로 인한 것인지 확인하는 것이 좋습니다(그림 2F).
transfection 실험의 경우 BFP와 같은 추가 형광 단백질 융합과 함께 epigenome editor를 사용하는 것이 좋습니다. 이 융합을 통해 현미경 및 유세포 분석을 통해 epigenome editor로 성공적으로 tra...

Plasmid DNA Transfection 및 mRNA Nucleofection Delivery를 사용한 인간 세포의 CRISPR 에피게놈 편집

Epigenetics refers to chemical modifications of histone proteins and DNA that can regulate the expression of genes. The human epigenome is altered ...

crispr-epigenome-editing-human-cells-using-plasmid-dna-transfection

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 동영상은 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 아연-핑거 뉴클레아제 기반 게놈 편집 기술을 보여줍니다. hPSC는 잠재적으로 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 이 기술은 환자 맞춤형 방식으로 체외 병리학 및 약리학 연구에 도움이 됩니다.

Zinc Finger Nuclease-based genome editing: double-stranded homology dependent repair mechanism에 의한 인간 만능 줄기세포의 게놈 수정 기법

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

학습하세요 인간 세포에서 CRISPR 기반 에피게놈 편집을 위한 플라스미드 DNA 트랜스펙션과 mRNA 뉴클레오펙션 방법. dCas9에 크로마틴 이펙터를 융합하여 DNA 절단 없이 유전자 발현을 조절하는 기술입니다.

Plasmid DNA Transfection 및 mRNA Nucleofection Delivery를 사용한 인간 세포의 CRISPR 에피게놈 편집

더 많은 동영상 탐색