Sprague-Dawley (SD) 쥐에서 일차 망막 뮐러 세포의 분리 및 배양

이 프로토콜은 Sprague-Dawley SD 쥐로부터 일차 망막 뮬러 세포의 분리 및 배양을 설명하며, 이는 과학계의 망막 연구에 도움이 될 수 있습니다. 프로토콜은 망막 박리, CI 추출 및 식별, 주요 제어 고려 사항을 다룹니다. 이 프로토콜은 법적 SD 랙에서 RMC를 추출하고 복구하기 위한 효율적이고 표준화되었으며 비용 효율적인 방법을 설정합니다. RMC 모델은 당뇨병, 정상과 같은 병리학적 상태를 시뮬레이션하고 약물 효과를 지원하는 데 사용할 수 있습니다.

[해설자] 시작하려면 D-Hank의 용액을 10cm 유리 배양 접시 2개에 붓습니다. 신생아 SD 쥐를 안락사시키고 소독한 후, 멸균된 곡선 접시 위에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 눈꺼풀 균열을 따라 눈꺼풀 피부를 찢어 쥐의 안구를 노출시킵니다. 이빨이 없는 핀셋을 열어 눈금 균열과 평행하게 유지하여 안와를 누릅니다. 시신경에 도달하고 안구가 노출되면 핀셋을 닫아 안구를 들어 올려 추출합니다. 이제 D-Hank의 용액이 담긴 유리 배양 접시에 안구를 넣습니다. 안구를 헹구고 신선한 D-행크 용액이 담긴 다른 접시에 옮깁니다. 그런 다음 구부러진 안과용 마이크로 겸자를 사용하여 각막과 시신경 사이의 영역을 부드럽게 고정하여 각막을 노출시킵니다. 마이크로 각막 가위를 사용하여 각막 공막 접합부를 뚫고 윤부를 따라 원형으로 자릅니다. 집게를 풀고 시신경과 공막의 접합부에서 리클램핑하기 전에 약 2mm 길이의 대칭 공막 절개를 두 개 합니다. 그런 다음 두 번째 집게를 사용하여 시신경근 근처를 부드럽게 눌러 각막 시신경 경계면을 향해 압력을 가합니다. 수정체 조직이 나타나면 조심스럽게 제거하고 망막 조직이 나올 때까지 계속 누릅니다. 겸자를 사용하여 분리된 망막 조직을 다른 멸균 배양 접시로 옮깁니다. 배양 접시 뚜껑을 열고 팁이 1밀리리터인 피펫을 사용하여 망막 조직을 위아래로 약 15회 피펫팅하여 작은 조각으로 부수십시오. 그런 다음 조직을 섭씨 37도에서 0.25% 트립신 1밀리리터와 함께 5분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 배양 접시를 꺼내 깨끗한 벤치에 놓습니다. 완전 배지 2밀리리터를 넣고 부드럽게 피펫팅하여 소화를 멈춥니다. 이제 300 메쉬 나일론 스크린을 통해 세포 현탁액을 15 밀리리터 원심 분리기 2로 여과합니다. 준비된 PBS로 배양 접시를 세척하고 남은 현탁액을 수집합니다. 그런 다음 튜브를 실온에서 5분 동안 878G에서 회전시킵니다. 원심분리 후 상청액을 흡인하여 버립니다. 펠릿을 2밀리리터의 완전 배지에 재현탁하고 878G에서 5분 동안 다시 원심분리하여 세포를 정제합니다. 상청액을 버린 후 세포를 2밀리리터의 완전 배지에 재현탁합니다. T25 플라스크에 3밀리리터의 완전 배지가 담겨 1밀리리터의 세포 현탁액을 첨가합니다. 인큐베이터에 넣기 전에 플라스크를 십자형 패턴으로 흔듭니다. 배양 48시간 후 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 깨끗한 벤치에 놓습니다. 사용한 배지를 버리고 1% 페니실린과 스트렙토마이신을 함유한 PBS 1밀리리터로 세포 부착 표면을 세 번 세척합니다. 그런 다음 5밀리리터의 신선하고 완전한 배지를 추가하고 세포 융합성이 90%를 초과할 때까지 배양을 계속합니다. 1% 페니실린 스트렙토마이신을 함유한 PBS 1밀리리터로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 세포를 1밀리리터의 0.25% 트립신 EDTA 용액과 함께 1분 30초 동안 배양합니다. 이제 도립 현미경으로 플라스크를 관찰하십시오. 세포가 둥글고 분리되어 나타나 떠오르기 시작하면 플라스크에 2밀리리터의 완전 배양 배지를 추가하여 소화를 종료합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 흡인하고 전체 세포 현탁액을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 1% 페니실린 스트렙토마이신이 함유된 PBS 2밀리리터로 플라스크 벽을 헹구고 동일한 튜브에 추가합니다. 튜브를 실온에서 5분 동안 878G에서 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 적절한 부피의 완전 배지에 재현탁합니다. 마지막으로, 필요에 따라 1:2 또는 1:3의 비율로 세포를 계대시킵니다. 두 번째 계대 망막 뮬러 세포 또는 RMC는 원형 또는 타원형 핵과 풍부한 세포질을 가진 별 모양 또는 방추 모양의 형태를 나타냈습니다. 헤마목실린과 에오신 염색은 풍부한 분홍색 세포질과 미세한 사상 구조로 상호 연결된 중앙에 위치한 타원형 핵을 가진 방추 및 별 모양의 세포를 나타냈습니다. RMC의 면역형광 염색은 글루타민 합성효소 및 아쿠아포린-4에 대해 표지된 세포에서 강한 적색 형광과 CRALBP, Kir4.1 및 비멘틴에 대해 밝은 녹색 형광을 나타냈습니다. NeuN, 음성 대조군은 RMC 분리의 특이성을 확인하는 면역형광 분석에서 검출되지 않았습니다. 유세포 분석 결과 세포의 98.7%가 글루타민 합성효소에 대해 양성이었고 97%가 CRALBP에 대해 양성인 것으로 나타났으며, 이는 RMC의 순도가 높음을 나타냅니다.