정상 조직에서 암 조직으로의 진행을 모델링하는 식도 오가노이드의 확립 및 조직학적 분석

우리의 연구는 종양 개시 및 초기 종양 형성에 중점을 둡니다. 우리는 정상 세포가 종양 세포로 어떻게 변형되는지, 그리고 이러한 세포가 종양 형성을 촉진하기 위해 미세 환경을 어떻게 변형하는지 조사합니다. 현재 줄기세포 기술, 유전자 편집 기술, 첨단 3D 배양 시스템 및 생체 재료, 단일 세포 및 공간 오믹스 기술 등 연구를 촉진하는 데 사용되는 많은 기술이 있습니다. 우리가 직면한 가장 큰 과제는 오가노이드에 박테리아와 곰팡이가 없도록 하는 것입니다. 이러한 오염 물질은 조직 취급 및 운송 중에 몰래 유입되어 종종 배양을 망칩니다.

[강사] 시작하려면 기저막 매트릭스와 인간 식도 오가노이드 배양 배지를 섭씨 4도에서 해동합니다. 조직 샘플을 5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 실온 세척 완충액으로 샘플을 세 번 세척합니다. 멸균 가위를 사용하여 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에서 조직을 1밀리미터 입방체 조각으로 다집니다. 이제 조직 조각을 1밀리리터의 소화 완충액에 현탁합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 분당 50-100회전으로 10-20분 동안 흔들어 조직을 소화시킵니다. 다음으로, 혼합물을 섭씨 4도에서 5분 동안 400G에서 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 버립니다. 펠릿을 500마이크로리터의 0.025% 트립신-EDTA에 재현탁합니다. 현탁액을 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 효소 활성을 멈추기 위해 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 현탁액을 70마이크로미터 멸균 필터에 통과시키고 여과액을 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 모아줍니다. 여과액을 섭씨 4도에서 400G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버린 후 세포를 100마이크로리터의 H-EOCM에 재현탁합니다. 세포를 재현탁한 후 세포 계수기를 사용하여 세포 밀도를 결정합니다. 그런 다음 밀리리터당 5,000-15,000개의 세포를 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 오가노이드 파종의 경우, 50-100마이크로리터의 기저막 매트릭스에 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 50마이크로리터의 매트릭스 세포 혼합물을 24웰 플레이트의 각 웰 중앙에 피펫팅합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 기저막 매트릭스를 중합시킵니다. 이제 500마이크로리터의 예열 H-EOCM을 각 웰에 피펫으로 넣어 매트릭스를 덮습니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소가 함유된 가습 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 배지를 교체하려면 사용한 배지를 흡인하십시오. 섭씨 37도로 예열된 500마이크로리터의 신선한 H-EOCM으로 각 웰을 보충합니다. 재파라핀화 및 재수화된 오가노이드에 대해 다중 면역형광 염색을 수행합니다. 양 혈청 차단 용액을 첨가하여 습도 챔버에 놓인 슬라이드의 오가노이드를 덮고 슬라이드를 실온에서 30분 동안 배양합니다. PBS 함유 트윈으로 슬라이드를 2분 동안 세척합니다. 다음으로, 희석된 1차 항체를 떨어뜨려 오가노이드 영역을 덮습니다. 항체 요구 사항에 따라 습도 챔버에서 배양합니다. 배양 후, PBS-T에서 슬라이드를 내열성 챔버에서 80PMM에서 2분 동안 2회 세척합니다. 이제 2차 항체 용액을 오가노이드 영역에 떨어뜨리고 실온의 습도 챔버에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, PBS-T에서 슬라이드를 내열성 챔버에서 80RPM에서 2분 동안 2회 세척합니다. 세척된 슬라이드 위에 형광 염료 용액을 피펫팅하여 오가노이드 영역을 덮고 다시 배양합니다. 배양 후 PBS-T에서 슬라이드를 두 번 세척합니다. 다중 염색의 경우 항원 회수 및 항체 차단을 반복합니다. 그런 다음 오가노이드 영역을 덮기 위해 dappy 용액을 떨어뜨립니다. 슬라이드를 멸균수에 2분 동안 담가 여분의 얼룩을 씻어냅니다. 디지털 이미지를 획득하기 전에 퇴색 방지 마운팅 매체를 추가하고 커버 슬립을 적용하십시오. 오가노이드 구조는 KRT6A 염색에 의해 시각화된 바와 같이 정상 단계에서 암종 단계까지 점점 더 무질서해졌습니다. PDL1의 발현은 정상 식도 점막에서 식도 편평 세포 암종으로 점진적으로 증가했습니다.