En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

망막은 신경 계산을 이해하는 데 유용한 모델입니다. 이러한 계산은 셀의 특수 위치에 따라 달라집니다. 그러나 이에 대한 포괄적인 지도는 여전히 파악하기 어려운 상태로 남아 있습니다.

지난 10년 동안 단일 세포 시퀀싱은 망막 세포 유형에 대한 명확한 설명을 제공했습니다. 이제 공간 전사체학은 온전한 조직에서 이러한 설명을 사용하는 새로운 방법을 제공합니다. 공간 전사체학을 사용하는 데 있어 중요한 과제는 매우 얇은 조직 절편이 필요하다는 것입니다. 망막은 우리가 관심 있는 수평면에서 이미 상당히 얇습니다.

얇고 빠른 절편을 만들기 위해 이 방법을 발명함으로써 기계 학습에서 공간 전사체학을 사용하여 동일한 조직의 모든 망막 신경절 세포를 매핑합니다. 지난 30년 동안 45마리의 쥐의 망막 신경절 세포 중 17개만이 매핑되었으며, 이 기술을 통해 모든 세포를 한 번에 매핑할 수 있었습니다.

[강사] 시작하려면 안락사된 마우스를 작업대 위에 놓습니다. 방향을 유지하고 해부를 위한 약점을 만들기 위해 각막에 지구의 측두극을 실행했습니다. 지구본을 담그고 여과지가 들어 있는 접시에 용액을 조준합니다. 날카로운 5번 집게와 홍채 가위를 사용하여 공막에 구멍을 뚫지 않고 지구에서 모든 근육 조직, 근막, 맥관 구조 및 신경을 조심스럽게 제거합니다. 홍채 가위 날의 끝을 각막 브랜드에 수직으로 배치합니다. 이 위치에서 지구본에 구멍을 뚫습니다. 각막과 윤부를 통해 한 번 깨끗하게 절개하고 공막과 망막으로 시신경 유두를 향해 계속합니다. 그런 다음 칼날을 윤부에서 약 1mm 뒤쪽으로 초기 절단에 수직으로 배치합니다. 공막과 망막을 방사형으로 절단하기 시작합니다. 날카로운 집게를 사용하여 지구를 안내하고 회전시켜 윤부와 평행한 후방 및 평행한 절단선을 유지합니다. 망막과 공막이 분리되면 홍채 가위 날의 위치를 변경하여 함께 자릅니다. 홍채 가위 날의 중간 너비를 사용하여 1mm 후방 거리를 추정합니다. 윤부와 평행한 방사형 절단을 완료한 후 망막 연결이 남아 있는지 검사합니다. 전방과 후방 안구 부분이 분리될 때까지 홍채 가위로 조심스럽게 절단합니다. 다음으로, 두 쌍의 날카로운 숫자 5 집게를 사용하여 지구의 앞쪽과 뒤쪽 부분을 부드럽게 분리합니다. 나이가 많은 마우스에서 투명한 섬유가 수정체를 망막 컵에 연결하는 경우 망막 공막 분리를 최소화하면서 홍채 가위로 조심스럽게 절단합니다. 여과지를 지지 플랫폼으로 사용하여 망막을 홍채 가위로 철 십자 패턴이라고도 하는 클로버 잎으로 자릅니다. 두 번째 눈으로 해부를 반복합니다. 일회용 플라스틱 이송 피펫의 끝을 잘라 해부된 망막과 공막보다 더 큰 구멍을 만듭니다. 망막을 피펫으로 부드럽게 흡입하여 유리 현미경 슬라이드에 넣습니다. 실험실 물티슈를 사용하여 망막이 더 이상 뜨지 않고 평평해질 수 있을 때까지 과도한 조준 용액을 제거합니다. 이제 두 개의 날카로운 숫자 5 집게를 사용하여 망막을 펼치고 안쪽 안구 컵이 위를 향하도록 평평하게 배치합니다. 각 클로버 릴리프 세그먼트에 0.5-2mm 길이의 릴리프 컷을 만들어 평평하게 만들고 접히지 않도록 조정합니다. 망막에 인접한 액체를 제외하고 남아 있는 조준 용액을 제거합니다. 커버 슬립을 사용하여 망막을 빠르게 누르고 옮겨 외부 공막이 위를 향하고 안쪽 아이 컵이 커버 슬립에 닿도록 합니다. 망막이 접히지 않았는지 확인하고 필요한 경우 조정하십시오. 조작을 돕기 위해 조준 용액을 추가하되 말림을 방지하기 위해 물티슈로 여분의 부분을 제거하고 5-10초 동안 자연 건조시킵니다. 이제 OCT 배지를 적용하여 망막을 덮습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 부양을 방지하기 위해 커버 슬립 전체에 층을 고르게 펴십시오. 액체 질소 증기로 냉각된 금속판을 사용하거나 드라이아이스와 직접 접촉하여 OCT 배지에서 망막을 급속 동결합니다. 냉동 망막은 드라이아이스 위에 보관하여 즉시 사용할 수 있습니다. 냉동절편을 위해 시편 척에 OCT 돔을 만들고 동일한 극저온 조절기 모델을 사용하는 경우 내부 2-3개의 고리를 차지합니다. 시편 척을 절단면에 평평하게 맞춥니다. 척과 극저온 조절기 스테이지와 관련된 방향 가이드를 작성하거나 기록해 둡니다. 그런 다음 돔을 다듬어 블레이드와 평행한 평평한 표면을 형성합니다. 면도날을 사용하여 과도한 OCT를 측면으로 제거하고 망막을 커버 슬립에서 조심스럽게 분리하여 움직일 수 있도록 합니다. 스테이지에서 척을 제거하고 준비된 평평한 OCT 표면에 액체 OCT를 소량 떨어뜨립니다. 그런 다음 망막을 액체 OCT 위에 직접 놓습니다. 미리 식힌 유리 슬라이드를 사용하여 얼 때까지 망막을 누르고 있습니다. 접착을 보장하기 위해 망막과 척에 더 많은 OCT를 적용합니다. 그런 다음 극저온 조절기 급속 냉동 영역에서 어셈블리를 동결합니다. 절편을 위해 망막이 보일 때까지 과도한 OCT를 조심스럽게 다듬습니다. 면도날을 사용하여 OCT 블록 가장자리를 망막에 가깝게 만듭니다. 공막의 존재를 검사하는 동안 트리밍을 계속하십시오. 공막이 보이면 필요에 따라 s를 조정합니다.tage 각도. 공막이 섹션에 거의 고르게 분포되어 있으면 트리밍을 중지하십시오. 이제 미리 식힌 슬라이드와 두 개의 페인트 브러시를 사용하여 섹션을 조작하고 수집합니다. OCT가 녹아 조직이 슬라이드에 부착될 때까지 약 5초 동안 섹션 아래에 손가락을 놓습니다. 그런 다음 슬라이드를 차가운 표면으로 되돌려 재동결합니다. 준비된 슬라이드를 드라이아이스에 보관하여 즉시 사용하십시오. 신경절 세포층의 뚜렷한 면역반응성 또는 RBPMS와 토마토 렉틴으로 표지된 혈관 신경총의 명확한 분리는 망막 라미네이션 및 단백질 마커의 성공적인 보존을 확인했습니다. 12-plex RNA Scope 패널을 사용한 다중 RNA 검출은 공간 구조를 성공적으로 유지하고 얼굴 슬라이스 전반에 걸쳐 Grm6 및 RBPMS와 같은 마커의 뚜렷한 발현을 나타냈습니다. 고해상도 이미지는 RBPMS 및 Mafb6 및 Meis2와 같은 기타 마커에 대한 단일 세포 발현 패턴을 확인하여 신경절 세포층에서 단백질 및 RNA 국소화를 모두 검증했습니다. 클로버 잎 절편에 걸친 균일한 신호 분포와 xenium 공간 전사체 데이터의 강력한 신호는 성공적인 고처리량 프로파일링 및 RNA 무결성을 확인했습니다. xenium을 사용한 단일 세포 분해능 시각화는 플랫폼 전반에 걸쳐 프로토콜의 견고성을 확인하는 수동 검출 패턴과 일치했습니다. 세포 유형 특이적 전사체 마커는 망막 단면과 얼굴 매핑에서 층화된 층류 분포를 보였으며 깊이에 걸쳐 위치를 보존했습니다. 신경절 세포층을 자세히 확대하여 DAPI 핵 염색과 관련된 정확한 공간 전사체 검출을 확인했습니다.