모든 유충 단계에서 이미징하는 고해상도 C. elegans

연구실에서 우리는 모든 종류의 발달 생물학 질문을 연구합니다. 나 자신은 이미징 기술을 사용하여 이러한 질문을 더 잘 해결할 수 있는 방법을 개발하면서 기술적인 측면에서 더 많이 일하고 있습니다. C. elegans 분야는 CRISPR 유전자 편집, 전사체학 및 단백질체학에서 초고해상도 현미경에 이르기까지 매우 다양한 방법을 성공적으로 채택했습니다. C. elegans는 놀라운 모델이지만 고해상도의 생체 내 관찰의 맥락에서 최상의 해상도를 위해 고정이 필요한 문제가 있어 동물의 생존력이 제한됩니다. 이 프로토콜은 장기 C. elegans 이미징을 위한 한 가지 가능한 솔루션을 제시하여 연구자가 자체 실험실에서 이 방법을 채택하고 생체 내에서 직접 다양한 동적 발달 과정을 연구할 수 있도록 합니다. 실험실 내에서 이 방법을 사용하면 예를 들어 형태 형성의 맥락에서 또는 체세포 분열에 이어 성인기까지 장기 형성을 자세히 관찰할 수 있습니다. 이후 이 방법은 다양한 발달 과정을 연구하는 수많은 실험실에서 채택되었습니다.

[발표자] 시작하려면 장치를 지지 프레임에 부착하고 정립 현미경에 장착합니다. 주사기에 탈이온수를 채운 다음 23게이지 바늘과 속이 빈 구부러진 강철 핀으로 1 x 16인치 튜브의 긴 조각을 부착합니다. 주사기의 탈이온수로 튜브를 채우고 밸브 입구의 천공 구멍에 강철 핀을 삽입하여 튜브를 연결합니다. 오프칩 솔레노이드에 튜브를 부착하기 전에 주사기와 바늘을 제거하십시오. 이미징 소프트웨어를 사용하여 솔레노이드를 켜고 몇 분 동안 장치에 압력을 가하여 밸브에서 모든 공기를 배출합니다. 공기 물 인터페이스가 어둡게 나타나고 PDMS 재질 속으로 사라지는지 육안으로 확인하여 완료를 확인합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 솔레노이드를 끕니다. 그런 다음 1밀리리터 주사기에 여과된 박테리아 용액을 채우고 30게이지 바늘과 1 x 32인치 튜브의 긴 조각을 바늘에 부착합니다. 플런저를 눌러 바늘과 부착된 튜브를 모두 박테리아 용액으로 채웁니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 32인치 튜브를 미세유체 장치의 식품 입구에 직접 삽입하고 주사기를 주사기 펌프에 놓습니다. 뒷면의 나비 나사를 사용하여 주사기 플런저를 눌러 장치에 액체를 채웁니다. 밀봉된 강철 핀으로 웜 입구와 출구를 모두 막고 고정 나사를 사용하여 추가 압력을 가하여 장치에서 남아 있는 공기를 제거합니다. 그런 다음 배출구에서 막힌 강철 핀을 제거하고 폐기물 용기를 배출구에 부착합니다. 주사기를 밀어 폐기물 용기가 제대로 연결되어 있고 시스템에 막힌 부분이 없는지 확인합니다. 입구에서 두 번째 막힌 강철 핀을 제거하고 웜 입구에 작은 액체 방울이 나타날 때까지 주사기를 밉니다. 그런 다음 23게이지 바늘을 사용하여 약 15-20센티미터 크기의 더 긴 1 x 16인치 튜브 조각을 S-기저 완충액으로 채워진 1밀리리터 주사기에 부착합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 직선 23게이지 강철 핀을 부착합니다. 주사기의 S-기저 완충액으로 바늘과 튜브를 채웁니다. 이제 튜브 끝에 있는 강철 핀을 웜이 들어 있는 튜브에 삽입하고 튜브를 통해 소량의 액체를 밀어 공기가 남지 않도록 합니다. 웜을 주사기에 당기지 않고 튜브로 당깁니다. 그런 다음 강철 핀에 작은 액체 방울이 나타날 때까지 웜에 연결된 주사기를 밀고 강철 핀을 미세유체 장치의 웜 입구에 삽입합니다. 장치를 5배 또는 10배의 저배율로 현미경에 놓거나 해부 현미경에 놓습니다. 입구가 필드의 한쪽에 보이도록 장치를 배치합니다.view 트랩 채널 입구의 뒷면이 다른 쪽에 보입니다. 웜 주사기의 플런저를 부드럽게 누릅니다. 다음으로, 동물을 채널 어레이 쪽으로 밀어냅니다. 동물이 채널을 향하면 채널 안으로 밀어 넣고 추가 동물에 대해 반복합니다. 충분한 동물을 포획한 후 실험 내내 유지될 현미경 스테이지의 웜 입구에 부착된 주사기를 놓습니다. 해부 현미경에서 로딩을 수행한 경우 장치를 이미징 현미경으로 옮깁니다. 이제 주사기 펌프를 켜고 0.5마이크로리터에 대해 시간당 1마이크로리터의 사전 설정된 속도로 가동합니다. 0.5마이크로리터에 대해 시간당 1마이크로리터로 작동하도록 주사기 펌프를 프로그래밍한 후 0.5마이크로리터에 대해 유속을 시간당 100마이크로리터씩 증가시키고 실험 내내 흐름 패턴이 반복됩니다. 장치를 현미경 스테이지에 놓고 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오. 원하는 이미징 배율로 전환합니다. 트랩 채널 어레이 내에서 동물과 관심 영역을 식별하고 원하는 이미징 조건을 설정합니다. 원하는 이미징 조건에서 이미지를 촬영하고 이미지 획득 10초 전에 솔레노이드를 통해 온칩 밸브를 작동시켜 동물을 제자리에 고정합니다. 미세유체 장치는 170마이크로미터 두께의 커버 유리를 사용하여 명시야, 낙후형광, 회전 디스크 공초점 및 초고해상도 방법을 포함한 다양한 현미경 양식에서 높은 이미징 품질을 유지했습니다. 초기 L1에서 중간 L2 유충 단계까지 시각화된 Caenorhabditis elegans 상피 세포의 발달. 1차 퇴색된 외음부 전구체 세포의 유도와 후기 L1에서 초기 L4 유충 단계로의 후속 분열이 분명했습니다. 외음부 형성 단계는 초기 L3부터 성인기까지입니다. 획득한 이미지는 이미지 디콘볼루션 및 등록을 통해 향상되어 시각적 선명도를 향상시켰습니다. 보이는 세포 분열은 모든 동물에서 일관되고 시기적절한 방식으로 발생했으며 모든 분열은 일반적인 유충 단계 기간 내에 완료되었습니다. 생식선 길이는 L2 및 L3 단계에서 꾸준히 증가했으며 동물의 직선 방향으로 인해 일관된 측정이 가능했습니다.