Name: 포유류 배아의 유리화를 위한 주걱 몬테비데오 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 배우세요 주걱 몬테비데오 장치를 이용한 쥐와 양의 착상 전 배아 유리화 방법입니다. 자제품 도구와 액체 질소를 활용하여 고비용 장비 없이도 높은 생존율의 배아 동결 보존이 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

쥐 배아를 얻기 위해 사용된 동물은 국내법 18.611 및 국제 동물 관리 지침11에 따라 수용 및 처리되었습니다. 실험 프로토콜(허가 번호 #007-18)은 몬테비데오 파스퇴르 연구소 동물 보호 및 사용 위원회(Institut Pasteur de Montevideo Animal Care and Use Committee)에 의해 적절한 시기에 승인되었습니다(서면 동의서가 제공되었습니다). 양의 난모세포/배아에 대한 실험 프로토콜은 ARRIVE 가이드라인12 을 준수하고 국제 동물 관리 가이드라인11에 따라 수행되었으며, Institutional Animal Care Committee Fundación IRAUy (protocol #001-2017)에 의해 승인되었다.
1. 유리화(그림 2)
<ol>
	<li>주걱 MVD 준비<ol>
		<li>처음 10mm와 팁 콘을 잘라 젤 로더 팁( 재료 표 참조)을 줄입니다. 참고: 이렇게 하면 더 짧고 곧은 팁이 생성되어 0.5mL 빨대로 최종 밀봉을 용이하게 합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>팁에서 약 5cm 떨어진 곳에서 워치메이커의 #1.0 집게( 재료 표 참조)로 젤 로더 팁의 끝을 잡습니다. 팁을 분젠 버너( 재료 표 참조)의 화염에 부드럽게 넣고 8-10초 동안 유지하여 약 1mm2의 꽃잎 모양 플랫폼을 형성합니다.</li>
		<li>불에서 내리고 집게로 5초 동안 단단히 잡습니다.</li>
		<li>실체 현미경 ( 재료 표 참조)을 사용하여 꽃잎 모양의 플랫폼 (~ 1mm2)이 형성되고 원위 가장자리가 밀봉되어 있는지 확인하십시오. 참고: 플랫폼은 유리화 중 LN2 침투를 방지하기 위해 말단 끝에서 닫아야 합니다. 플랫폼이 깨끗하고 플라스틱 나사산이 없는지 확인하십시오. 너무 작거나 나사산이 있는 경우 팁을 자르고 절차를 반복하십시오.</li>
		<li>1.1.1-1.1.4 단계를 반복하여 필요한 수의 주걱을 준비합니다(주걱 1개 = 최대 40개의 마우스 배아).</li>
		<li>자외선(UV) 또는 에틸렌 옥사이드를 사용하여 주걱을 살균하고 멸균 튜브 또는 상자에 보관하십시오.</li>
		<li>유리화 당일에는 주걱을 회수하여 플랫폼의 반대쪽 끝에서 처리합니다. 각 주걱에 식별 막대( 재료 표 참조)를 삽입하고 실체 현미경 베이스에 놓습니다. 막대에 영구 마커 또는 액체 질소 내성 스티커 라벨로 레이블을 지정합니다. 알림: 주걱을 다룰 때는 항상 플랫폼을 만지지 마십시오. 전체 장치(주걱 + 0.5mL 빨대 + 식별 막대)의 총 길이는 잔 길이의 1cm를 초과해서는 안 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>유리화 용액의 준비<ol>
		<li>FS 용액을 준비합니다: 1.5g의 밀도 구배 매체( 재료 표 참조)와 0.85g의 자당( 재료 표 참조)을 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS, 재료 표 참조)에 용해합니다. 끓는 물에 완전히 녹을 때까지 가열한 다음 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다( 재료 표 참조). 참고: 이 용액은 최대 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>유리화 전 용액(PV) 준비: 유리화 당일에 10% 에틸렌 글리콜( 재료 표 참조), 10% 디메틸 설폭사이드( 재료 표 참조) 및 80% M2 매체( 재료 표 참조)를 혼합합니다. 5개의 주걱에 대해 총 100μL의 부피가 필요합니다.</li>
		<li>유리화 용액 준비(V): 유리화 당일에 15% 에틸렌 글리콜, 15% 디메틸 설폭사이드, 10% M2 배지 및 60% FS 용액을 결합합니다. 5개의 주걱에 대해 총 부피 100μL가 필요합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>배아 탈수 및 유리화 과정<ol>
		<li>LN2 준비: LN2 를 적절한 용기(예: 10cm x 30cm x 20cm 절연 폴리스티렌 용기)에 붓고 사용할 주걱만큼 0.5mL 빨대를 놓습니다. 참고: LN2 하에서 조작하는 동안 주걱 플랫폼의 시각화를 용이하게 하기 위해 착색된 바닥 절연 폴리스티렌 용기를 사용하여 대비 효과를 생성하는 것이 좋습니다. 주의: LN2를 다룰 때는 적절한 고글과 장갑(재료표 참조)을 착용하십시오.</li>
		<li>용액 준비: 100mm 플라스틱 페트리 접시( 재료 표 참조)에 각 주걱에 대해 100μL의 M2, 20μL의 PV 용액 및 20μL의 V 용액을 떨어뜨립니다.</li>
		<li>유리화 배아: 유리화할 배아를 M2 드롭에 넣습니다. 한 번에 30-40개의 배아를 처리하고, PV 용액 드롭에서 30초 동안 배양한 다음 실온(RT)에서 30초 동안 V 용액 드롭에서 배양합니다.</li>
		<li>흡입기 튜브 어셈블리와 함께 인발 유리 모세관( 재료 표 참조)을 사용합니다( 재료 표 참조). 배아를 배치하기 전에 최소 1 μL의 각 용액을 모세관에 미리 로드합니다. 참고: 배아는 방울에서 다른 높이에 있으므로 실체 현미경 마이크로미터를 조정하여 배아의 위치를 파악하십시오. 10초가 남았을 때 각 방울에서 배아를 회수합니다. 모든 배아 조작은 실체현미경 하에서 수행되어야 합니다.</li>
		<li>배아 로드: 최소 V 용액(예: ~ 0.1 μL)을 사용하여 배아를 흡인하고 주걱 플랫폼에 빠르게 놓습니다.</li>
		<li>LN2에 담그기: 배아를 적재한 후 즉시 주걱 플랫폼을 LN2 에 5초 동안 담그십시오(막대를 잡고 손으로 주걱을 잡습니다). 그런 다음 주걱을 LN2 증기로 유지하면서 긴 스테인리스 스틸 핀셋을 사용하여 0.5mL 빨대로 밀봉합니다( 재료 표 참조). 알림: 예열 중 팽창을 방지하기 위해 밀봉하기 전에 빨대에서 LN2 를 제거하십시오. 배아 방울과 빨대 벽 사이의 접촉을 방지하기 위해 주걱과 빨대가 제대로 정렬되었는지 확인하십시오. 편의상 밀봉된 주걱은 모든 주걱에 배아가 적재될 때까지 LN2 용기에 남아 있을 수 있으며 필요에 따라 LN2 로 다시 채워질 수 있습니다.</li>
		<li>절차 반복: 새로운 PV 및 V 방울 쌍을 사용하여 각 배아 그룹에 대해 1.3.3-1.3.7단계를 반복합니다.</li>
		<li>보관: 주걱을 잔으로 옮긴 다음( 재료 표 참조) LN2 저장 듀어로 옮깁니다( 재료 표 참조).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig02.jpg"> 
그림 2: Spatula MVD를 사용한 유리화 공정 계획. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. BioRender에서 생성되었습니다. 마이클, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 온난화(그림 3)
<ol>
	<li>용액 준비<ol>
		<li>2.5mL의 M2 배지에 0.85g의 자당을 용해시키는 1M 자당 용액을 준비합니다. 0.22μm 필터로 용액을 멸균합니다. 참고: 이 용액은 최대 1주일 동안 4°C에서 준비하고 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>1M 슈크로스 용액을 적절한 부피의 M2 매체로 희석하여 0.5M 및 0.25M 슈크로스 용액을 준비합니다.</li>
		<li>온난화가 시작될 때까지 자당 용액을 핫 플레이트( 재료 표 참조)에서 37°C로 유지합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>온난화 플레이트 준비<ol>
		<li>100mm 플라스틱 페트리 접시에 0.5M 자당 500μL 방울, 0.5M 자당 50μL 방울, 0.5M 자당 50μL 방울 및 0.25M 자당 50μL 방울을 가열합니다. M2 배지 3방울(각 100μL)을 떨어뜨려 세척합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>온난화 과정 참고: 온난화 과정은 실온, 예를 들어 실체현미경 바닥에서 20-22°C와 같이 RT에서 발생합니다.<ol>
		<li>듀어에서 봉인된 주걱을 회수하십시오. LN2와 함께 적절한 용기에 넣습니다. 그림 3을 참조하십시오.</li>
		<li>실체현미경에 온난판을 놓습니다. 한 번에 하나씩 스테인리스 스틸 핀셋으로 주걱 바닥을 잡고 장갑을 낀 손으로 식별 막대를 꺼낸 다음 빨대를 꺼냅니다. 배아가 포함된 플랫폼을 500μL의 0.5M 자당 방울에 빠르게 담그십시오.</li>
		<li>모든 배아가 낙하 속으로 떨어졌는지 확인하십시오. 필요한 경우 주걱을 부드럽게 움직여 분리를 돕습니다. 배아를 풀드 유리 모세관에 넣고 0.5M 자당 용액의 50μL 방울에 넣고 2분 동안 배양합니다.</li>
		<li>배아를 0.25M 자당 용액의 50μL 방울에 넣고 2분 더 배양합니다. 참고: 각 용액에 배아를 넣기 전에 사용할 용액을 모세관에 미리 로드합니다.</li>
		<li>마지막으로, 배아를 M2 배지 방울로 세 번 씻어 자당을 제거합니다.</li>
		<li>사용하기 전에 최소 1시간 동안 각 종에 적합한 조건에서 배아를 배양합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig03.jpg"> 
그림 3: 주걱 MVD 가온 과정의 계획. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. BioRender에서 생성되었습니다. 마이클, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol><li>Crispo, M., Meikle, M. N., Rülicke, T. Cryopreservation of Valuable Mouse and Rat Lines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrispo%2C+M+%22Rodent+Quality+Control%3A+Genes+and+Bugs.+Laboratory+Animal+Science+and+Medicine%22">Rodent Quality Control: Genes and Bugs. Laboratory Animal Science and Medicine</a>. , Springer. Cham. (2024).</li>
<li>Lloyd, K., Franklin, C., Lutz, C., Magnuson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+use+mouse+biobanks+or+lose+them%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: use mouse biobanks or lose them.</a> Nature. 522 (7555), 151-153 (2015).</li>
<li>Hart-Johnson, S., Mankelow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archiving+genetically+altered+animals%3A+a+review+of+cryopreservation+and+recovery+methods+for+genome-edited+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Archiving genetically altered animals: a review of cryopreservation and recovery methods for genome-edited animals.</a> Lab Anim. 56 (1), 26-34 (2022).</li>
<li>Shaw, J. M., Jones, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology+associated+with+vitrification+and+other+cryopreservation+procedures+for+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos.</a> Hum Reprod Update. 9 (6), 583-605 (2003).</li>
<li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li>
<li>dos Santos Neto, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryotolerance+of+Day+2+or+Day+6+in+vitro+produced+ovine+embryos+after+vitrification+by+Cryotop+or+Spatula+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryotolerance of Day 2 or Day 6 in vitro produced ovine embryos after vitrification by Cryotop or Spatula methods.</a> Cryobiology. 70 (1), 17-22 (2015).</li>
<li>Renard, J. P., Babinet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+of+mouse+embryos+after+rapid+freezing+and+thawing+inside+plastic+straws+with+1-2+propanediol+as+cryoprotectant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">High survival of mouse embryos after rapid freezing and thawing inside plastic straws with 1-2 propanediol as cryoprotectant.</a> J Exp Zool. 230 (3), 443-448 (1984).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+cryopreservation+utilizing+a+novel+high-capacity+vitrification+spatula%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo cryopreservation utilizing a novel high-capacity vitrification spatula.</a> Biotechniques. 46 (7), 550-552 (2009).</li>
<li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos%3A+the+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).</li>
<li>Nakao, K., Nakagata, N., Katsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+vitrification+procedure+for+cryopreservation+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient vitrification procedure for cryopreservation of mouse embryos.</a> Exp Anim. 46 (3), 231-234 (1997).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).</li>
<li>du Sert, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARRIVE+guidelines+2.0%3A+Updated+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).</li>
<li>Meikle, M. N., Schlapp, G., Menchaca, A., Crispo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+volume+Spatula+MVD+vitrification+method+improves+embryo+survival+compared+to+traditional+slow+freezing%2C+both+for+in+vivo+and+in+vitro+produced+mice+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Minimum volume Spatula MVD vitrification method improves embryo survival compared to traditional slow freezing, both for in vivo and in vitro produced mice embryos.</a> Cryobiology. 84, 77-81 (2018).</li>
<li>Momozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+vitrification+of+mouse+embryos+using+the+Kitasato+Vitrification+System+as+a+novel+vitrification+device%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Efficient vitrification of mouse embryos using the Kitasato Vitrification System as a novel vitrification device.</a> Reprod Biol Endocrinol. 15 (1), 29(2017).</li>
<li>Stringfellow, D. A., Givens, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStringfellow%2C+DA+%22Manual+of+the+International+Embryo+Transfer+Society%3A+A+Procedural+Guide+and+General+Information+for+the+use+of+Embryo+Transfer+Technology+Emphasizing+Sanitary+Procedures%22">Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the use of Embryo Transfer Technology Emphasizing Sanitary Procedures</a>. , International Embryo Transfer Society. (2010).</li>
<li>Dos Santos-Neto, P. C., Cuadro, F., Barrera, N., Crispo, M., Menchaca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+survival+and+birth+rate+after+minimum+volume+vitrification+or+slow+freezing+of+in+vivo+and+in+vitro+produced+ovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Embryo survival and birth rate after minimum volume vitrification or slow freezing of in vivo and in vitro produced ovine embryos.</a> Cryobiology. 78, 8-14 (2017).</li>
<li>Schlapp, G., Meikle, M. N., Pórfido, J. L., Menchaca, A., Crispo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygote+cryobanking+applied+to+CRISPR%2FCas9+microinjection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zygote cryobanking applied to CRISPR/Cas9 microinjection in mice.</a> PLoS One. 19 (7), e0306617(2024).</li>
<li>Kamoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+oocyte%2Fembryo+vitrification+in+mammals+from+rodents+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances of oocyte/embryo vitrification in mammals from rodents and large animals.</a> Anim Sci J. 95 (1), e13931(2024).</li>
<li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos+using+low+concentrations+of+cryoprotectants%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos using low concentrations of cryoprotectants.</a> Cryobiology. 98, 127-133 (2021).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+embryos%3A+Advancement+of+putting+life+on+hold%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian embryos: Advancement of putting life on hold.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 163-175 (2010).</li>
</ol>

유전자 변형(GM) 동물 생성의 효율성은 엔도뉴클레아제 기반 방법, 특히 CRISPR/Cas9의 개발로 인해 크게 증가했습니다. 전 세계의 많은 실험실에서 유전자 부동을 방지하고 원래 표현형1의 무결성을 유지하기 위해 냉동 보존해야 하는 다양한 GM 마우스 및 쥐 계통을 생산합니다. 또한 보관을 통해 지속적인 번식의 필요성을 없애주어 종종 과도한 동물 수를 초래합니다. 일부 실험실에서는 GM 마우스 계통을 냉동 보존된 배아 또는 정자로 국제 저장소로 보내 살아있는 동물의 수송을 피하면서 이러한 모델의 교환을 용이하게 합니다. 이를 통해 동일한 GM 동물 모델을 반복적으로 생성하지 않고도 라인에 접근할 수 있습니다2. 이러한 이유로 배아 및 정자 동결 보존은 모든 GM 동물 시설에서 가장 중요합니다. 일반적으로 배아 동결 보존은 배아가 변형된 완전한 이배체 게놈을 포함하고 배아 이식을 통해 쉽게 회수할 수 있기 때문에 GM 계통을 저장하는 데 선호됩니다.
유리화(Vitrification)는 세포로 들어가는 물과 세포 주위에 세포외 결정을 형성하는 물 사이의 불균형을 특징으로 하는 비평형 과정입니다. 이 방법은 세포 내 얼음 결정의 형성을 방지하여 서속 동결 방법(SLF)3과 구별됩니다(그림 1 참조). 고농도의 동결 방지제와 액체 질소(LN2)와의 직접 접촉으로 초고속 냉각(~40°C/s)이 가능하여 몇 초 내에 샘플의 유리체 상태를 달성할 수 있습니다. 또한 유리화는 저속 냉동보다 빠르고 쉬우며 저렴합니다4. 최소한의 LN2가 필요하며 일반적으로 상업적으로 구매하거나 집에서 만들 수 있는 간단한 장비를 사용합니다(그림 1 참조).
또한 온난화 과정은 일반적으로 빠르고 복제 가능합니다. 동결 방지제 독성을 피하고 유리체 상태를 유지하기 위해 신속하게 수행해야 합니다3. 배아를 동결할 때 많은 실험실에서는 운반 장치의 편리함, 신뢰성, 견고성, 보유 용량 및 비용을 고려합니다.
우리는 양과 쥐 배아의 일상적인 동결 보존을 위해 MVD(Spatula Montevideo) 장치6을 사용하여 최소 부피의 주걱 유리화 방법을 선호합니다. 처음에는 서서냉 방법7 을 사용했지만 빠르게 유리화로 전환했습니다. LN2 듀어를 위한 더 간단하고 공간 효율적인 장치를 만들기 위해 Tsang and Chow (2009)8의 수제 주걱을 cryotube에 연결하여 0.5mL 빨대로 밀봉된 주걱 MVD를 개발했습니다( 재료 표 참조). 주걱에는 젤 로더 팁( 재료 표 참조)이 있으며, 여기서 약 1mm²의 플랫폼은 미세한 집게로 팁을 부드럽게 녹여 형성되어 배아를 적재하기 위한 꽃잎 모양의 플레이트를 만듭니다. 이 플랫폼은 작은 유리화 방울에 최대 40개의 마우스 배아를 수용할 수 있습니다. 식별 플러그 로드( 재료 표 참조)는 겔 로더 팁의 열린 끝단에 삽입됩니다.
이 방법의 목적은 간단하고 빠르며 저렴한 방법으로 배아를 유리화하는 것이며, 이를 통해 질소 듀어의 공간을 절약할 수 있습니다. 이 시스템은 수년 동안 성공적으로 사용되어 왔으며 특히 마우스 배아에서 우수한 배아 생존율(~97%)과 생식 결과를 제공합니다. 주걱 MVD는 실험실에서 준비하기 때문에 상용 장치에 비해 저렴한 방법입니다9. 또한, 극저온 튜브 8,10의 사용에 비해 질소 듀어의 공간을 절약합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig01.jpg"> 
그림 1: 배아 동결 보존에 사용되는 두 가지 주요 기술의 비교. 이 그림은 Crispo et al.1의 허가를 받아 수정되었습니다. BioRender.com 년에 생성되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 필터&nbsp;</td><td>사토리우스</td><td>16534</td><td>Minisart 주사기 필터 0.2 및 마이크로; L</td></tr><tr><td>0.5mL 빨대&nbsp;</td><td>미니튜브</td><td>13408/0044</td><td>프렌치 타입 미디엄 파이에트</td></tr><tr><td>흡인기 튜브 어셈블리&nbsp;</td><td>시그마</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>분젠 버너&nbsp;</td><td>인듀랩</td><td>7000134</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드&nbsp;</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜&nbsp;</td><td>시그마</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>피콜 PM70&nbsp;</td><td>시그마</td><td>F2878</td><td>밀도 구배 매체</td></tr><tr><td>젤 로더 팁</td><td>에펜도르프&nbsp;</td><td>10411193</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관&nbsp;</td><td>마리엔펠트</td><td>2900000</td><td>미세헤마토크리트 모세혈관</td></tr><tr><td>LN2 취급용 장갑&nbsp;</td><td>템프실드</td><td>세0338</td><td>냉동 장갑</td></tr><tr><td>받침 달린 컵</td><td>미니튜브</td><td>16913/1133</td><td></td></tr><tr><td>LN2 핸들링용 고글&nbsp; &nbsp;</td><td>3분</td><td>&nbsp; 40661-00000-10</td><td>김서림 방지, 긁힘 방지 코팅</td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>라벡</td><td>LA-SH-II-5B</td><td>디지털 모델</td></tr><tr><td>식별 막대&nbsp;</td><td>IMV 기술</td><td>6326</td><td>비멸균 LG48mm</td></tr><tr><td>절연 스티로폼 용기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN2 스토리지 듀어</td><td>테일러-와튼</td><td>XT21-AI</td><td>극저온 과학</td></tr><tr><td>긴 스테인리스 스틸 핀셋</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11000-25</td><td></td></tr><tr><td>M2&nbsp;</td><td>시그마</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>수제</td><td></td><td>인산염 완충 식염수. 일반적으로 1L의 농축 5x 완충액을 준비한 다음 1x로 희석합니다. 조리법: 염화나트륨 40g, 염화칼륨 1g, 무수 인산이나트륨 7.2g, 인산일칼륨 1.2g. 증류수를 넣고 오토클레이브로 멸균합니다.</td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시&nbsp;</td><td>송골매</td><td>&nbsp; &nbsp; 351029</td><td>TC 처리되지 않은 세균 페트리 접시</td></tr><tr><td>실체 현미경&nbsp;</td><td>올림푸스</td><td>SZ2-LGB</td><td></td></tr><tr><td>자당&nbsp;</td><td>시그마</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>워치메이커' s #5 집게&nbsp;</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11254-20</td><td></td></tr></tbody></table>

포유류 배아의 유리화를 위한 주걱 몬테비데오 장치

Spatula Montevideo Device for the Vitrification of Mammalian Embryos

This study describes an efficient and cost-effective vitrification method for mouse and sheep embryo cryopreservation known as the Spatula Montevideo ...

유전자 변형 마우스 모델을 생성한 다음 백업으로 라인을 동결 보존합니다. 이를 위해서는 배아를 유리화하는 쉽고 저렴하며 효율적이고 재현 가능한 방법이 필요합니다. CRISPR-Cas9의 미세 주입 또는 전기천공은 유리화, 워밍업 마우스 및 가축 접합체에서 수행될 수 있으므로 일정이 보다 유연해지고 사용 중인 동물이 줄어듭니다.배아 유리화는 초고속 냉각을 사용하여 얼음 결정 형성을 방지하고 세포 무결성을 보존합니다. 이 기술은 극저온 생물학 연구를 발전시켜 배아 생존력, 유전적 안정성 및 장기 보관 결과에 대한 연구를 가능하게 합니다. 주걱 MVD와 용액은 모두 수제입니다. 주걱은 0.5밀리리터 빨대로 밀봉되어 액체 질소 듀어에서 최소한의 공간을 차지합니다.[강사] 시작하려면 젤 로더 팁의 처음 10mm와 팁 콘을 잘라냅니다. 워치메이커의 5번 집게를 사용하여 젤 로더 팁의 끝을 팁에서 약 1cm 떨어진 곳에 잡고 분젠 버너 불꽃에 8-10초 동안 부드럽게 넣어 패들 모양의 플랫폼을 형성합니다. 이제 불꽃에서 팁을 제거하고 집게로 5초 동안 계속 단단히 잡습니다. 실체 현미경을 사용하여 약 1제곱밀리미터의 패들 모양의 플랫폼이 형성되었는지, 원위 가장자리가 밀봉되어 있는지 확인합니다. 제작된 주걱을 자외선을 사용하여 멸균하고 멸균 튜브 또는 상자에 보관합니다. 유리화 당일에는 주걱만큼 많은 막대에 라벨을 붙여 유성 마커 또는 액체 질소 저항성 스티커 라벨로 유리화합니다. 주걱을 하나씩 회수하여 플랫폼의 반대쪽 끝에서 취급합니다. 각 주걱에 식별 막대를 삽입하고 실체 현미경 베이스에 놓습니다. 10 x 30 x 20cm 크기의 절연 폴리스티렌 용기에 액체 질소를 붓습니다. 각 주걱에 대해 0.5밀리리터 빨대 1개를 용기에 넣습니다. 각 주걱에 대해 100mm 플라스틱 페트리 접시에 20마이크로리터의 M2 용액, 20마이크로리터의 PV 용액 및 20마이크로리터의 V 용액을 준비합니다. 실체 현미경 아래에서 30-40개의 배아를 M2 방울에 넣습니다. 흡인 튜브 어셈블리에 부착된 당긴 유리 모세관을 사용하여 모세관에 M2 배지와 최소 1마이크로리터의 PV 용액을 예압합니다. 배아를 흡인하고 PV 용액 방울에서 30초 동안 배양합니다. 모세관에 최소 1마이크로리터의 V 용액을 넣고 배아를 V 용액 방울로 옮깁니다. 실온에서 30초 더 배양합니다. 약 0.1마이크로리터의 최소 V 용액을 사용하여 배아를 흡인하고 주걱 플랫

spatula-montevideo-device-for-the-vitrification-of-mammalian-embryos

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

병아리 chorioallantoic 막 (CAM)은 angiogenesis와 tumorigenesis을 연구하는 독특한 자연 immunodeficient 지원 문화 환경입니다. 이 비디오 기사는 여자의 서로 다른 단계를...

병아리 예 비켜 문화와 예 비켜 CAM 어세이 : 그게 정말로 작동하는 방법

이 비디오는 수정된 마우스 배아의 주위 공간에 렌티바이러스 벡터를 전핵 주입하는 방법을 설명합니다. 렌티바이러스는 변형유전자를 포함하고 있으며, 이 유전자는 수정된 배아의 게놈에 통합되어 결국 형질전환 마우스를 생성한다.

렌티바이러스 벡터 기반 페리비텔린 주입: 관심 유전자를 수정된 단세포 마우스 난모세포로 transduction하는 방법

자궁 - 난관 배아 입금 자궁 전송을 수행 할 때 발생할 수있는 배아 유출을 방지하는 장벽으로 자궁 - 난관 접합부를 사용한다. 과 vasectomized 남성은 배아 전송 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 두 가지 기술을 설명합니다.

마우스 모델에서 자궁 - 난관 배아 전송 및 정관

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

MicroSecure Vitrification은 FDA 우수 제조 및 조직 취급 관행을 준수하는 비상업적인 무균 폐쇄 유리화 장치 시스템으로 개발되었습니다. 소수성 플러그 배아 빨대가 업계에서 철수함에 따라 유리화 절차는 표준 내부 면 플러그 앞에 내부 씰을 포함하도록 수정되었습니다.

수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

보조 생식 기술 (ARTs)은 결과를 개선 하 고 관련 위험을 줄이기 위해 지속적인 평가를 하 고 있습니다. 이 원고는 인간 재생의 이상적인 동물 모델로 서 토끼의 사용을 허용 하는 효율적인 냉동 보존 프로토콜을 가진 최소 침 습 배아 전달 절차를 설명 합니다.

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

여기 previtrification 개입 및 후 지구 온난화 복구 동안 blastocyst 수축 하 고 다시 확장의 강도 따라 시간 경과 형태학 프로토콜 선물이. 프로토콜의 응용 프로그램에서 체 외에서 수정 시간 경과 현미경을 장착 가능 하며 최적의 blastocyst vitrification 방법의 개발에 것이 좋습니다.

Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜

배반포 생검 및 유리화는 착상 전 유전자 검사를 효율적으로 수행하기 위해 필요합니다. 조나 펠루시다의 순차적 개방및 5-7일째에 7-8개의 트로페토더세포를 회수하는 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 이하의 환경 조건으로 제한한다.

인간 배반포 생검 및 유리화

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

여기에서는 난자 채취 후 적운-난모세포 복합체의 일부를 신속하게 제거하여 IVF 관찰 과정을 촉진하고, 과립층 세포 제거에 필요한 시간을 단축하고, 외부 요소에 대한 난모세포 노출을 최소화하고, 배아 발달을 방해하지 않으며, 궁극적으로 IVF 실험실 절차의 효율성을 향상시키는 최적화된 방법을 제시합니다.

The Immediate Partial Removal of Cumulus-Oocyte Complexes: A Refined Approach for Rapid Observation of In Vitro Fertilization(적운-난모 세포 복합체의 즉각적인 부분 제거: 체외 수정의 신속한 관찰을 위한 정제된 접근 방식)

배우세요 주걱 몬테비데오 장치를 이용한 쥐와 양의 착상 전 배아 유리화 방법입니다. 자제품 도구와 액체 질소를 활용하여 고비용 장비 없이도 높은 생존율의 배아 동결 보존이 가능합니다.

포유류 배아의 유리화를 위한 주걱 몬테비데오 장치

더 많은 동영상 탐색