마우스의 연수막 전이 연구를 위한 최소 침습적 수조 마그나 주입 모델

연수막 전이는 매우 심각하고 치명적인 형태의 전이성 질환입니다. 그 환경은 종양 세포와 고유한 조직 미세 환경 사이의 상호 작용에 따라 달라질 수 있습니다. 동물 모델에서는 기본 메커니즘을 연구하는 것이 매우 중요합니다.

생체 내에서 연수막 전이를 연구하기 위해 연구자들은 일반적으로 심장내, 경동맥 내 또는 암세포를 대수조 또는 뇌실에 직접 주사하는 등의 기술을 사용합니다. 이러한 접근 방식은 LM 연구를 위한 신뢰할 수 있는 마우스 모델을 생성하는 데 도움이 됩니다. 현재의 시도에는 눈에 띄는 한계가 있습니다. 예를 들어, 심장 내 주사는 종종 연수막 공간 외부에 종양을 생성하며 LM과 관련 없는 사망으로 이어질 수 있습니다. 경동맥 접근법은 매우 침습적이고 시간이 많이 걸립니다. 이 프로토콜은 LM 모델을 빠르게 생성할 수 있습니다. 혈액뇌장벽을 우회하여 종양 세포를 연수막 공간으로 정확하게 전달하며 수술 외상과 귀중한 시간을 모두 줄여줍니다.

[강사] 시작하려면 DMEM에 100만 개의 루이스 폐암 또는 LLC1 세포를 채취하고 10% 소태아 혈청과 1밀리리터당 0.1밀리그램의 페니실린-스트렙토마이신을 보충하고 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포가 70%에서 90% 컨플루션에 도달하면 0.25% 트립신 EDTA 용액 2밀리리터를 사용하여 1분 동안 트립신화합니다. 세포를 300G에서 3분 동안 원심분리하고 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 다시 세포를 원심분리하고 PBS 1밀리리터에 재현탁합니다. 혈구계와 트리판 블루 용액을 사용하여 생존 세포의 농도를 평가합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS에서 밀리리터당 200만 세포로 농도를 조정합니다. 조정된 세포 현탁액 50마이크로리터를 별도의 미세 원심분리기 튜브에 분취하여 반복적인 피펫팅을 최소화하고 주입 준비가 될 때까지 세포 현탁액을 얼음 위에 보관합니다. 쥐의 후두부 후두부 털을 면도한 후 제모 크림을 발라 같은 부위에 남아 있는 털을 완전히 제거합니다. 마우스를 엎드린 자세로 놓고 목을 15밀리리터 원심분리기 튜브 위에 올려 놓습니다. 머리와 허리를 테이프로 고정하고 검지로 후두부와 C1 척추 사이의 공간을 촉진합니다. 75% 에탄올에 적신 멸균 면봉을 사용하여 후두부 부위를 3회 닦은 후 Betadine 수술용 스크럽으로 청소합니다. 멸균 드레이프를 사용하여 동물의 비멸균 부분을 덮습니다. 세포 현탁액을 부드럽게 피펫팅하고 10마이크로리터를 31게이지 8mm 인슐린 주사기에 흡인합니다. 검지를 사용하여 마우스의 후두부와 C1 척추 사이의 공간을 촉진하여 후두두개골의 아래쪽 정중 가장자리에서 천자 부위를 찾습니다. 식별된 천자 부위를 통해 수조에 45-50도 각도로 바늘을 삽입하고 4mm 깊이까지 전진시킵니다. 주사기 플런저를 전진시켜 세포 현탁액을 천천히 주입하고 테이블에 손을 올려 주사기를 안정적으로 유지합니다. 접종 후 두개내압이 평형을 이룰 수 있도록 주사기를 추가로 10초 동안 제자리에 유지합니다. 그런 다음 바늘을 빼내고 멸균 면봉으로 천자 부위를 1-2분 동안 누릅니다. 생물발광 이미징의 경우, 마우스를 마취한 후, D-루시페린을 그램당 150마이크로그램의 D-루시페린을 안와후 정맥에 주입한다. 마우스를 이미징 챔버에 놓습니다. IVIS 시스템을 사용하여 노출 시간을 0.5초에서 2분 사이로 설정하여 즉시 동물을 이미지화합니다. 연수막 공간에서 성공적인 종양 세포 접종을 확인하기 위해 머리와 척수에 분산된 생물발광 신호를 식별합니다. 생체 내 생물발광 영상은 루이스 폐암 세포의 수조 내 마그나 주사가 뇌와 척수에 강한 신호 축적을 유도하여 성공적인 연수막 전이 형성을 나타내는 것으로 나타났습니다. 경동맥 내 주사는 연수막 전이 침범 없이 국소 뇌 실질 전이를 초래했습니다. 심장 내 주사는 광범위한 두개외 전이를 초래했으며 세 마리의 마우스에서 연수막 전이의 증거는 없었습니다. NSG 마우스에서 A549 세포의 수조 마그나 주사 후 유사한 전이 패턴이 관찰되어 모델 재현성이 확인되었습니다. 헤마트실린 에오신 염색은 실질이 아닌 연수막과 심실에 국한된 종양 세포를 보여주었습니다. 면역형광은 수막과 심실에서 조밀한 GFP 양성 종양 클러스터를 나타냈으며 실질에는 드물게 존재했습니다. 2광자 영상은 종양 세포가 두개골과 뇌 실질 사이의 연수막 공간 내에 국한되어 있음을 확인했습니다. 실체 형광 현미경은 또한 뇌 표면의 GFP 양성 종양 세포를 시각화했습니다.