효모 표면에 표시된 단백질의 Enzymatic modification and flow cytometry assessment (효소 변형 및 유세포 분석 평가)

이 연구는 세포의 행동 방식을 지시하는 단백질의 화학적 변형을 연구하는 데 중점을 둡니다. 이 경우 목표는 다양한 기질을 변형하는 효소의 선호도와 동역학을 이해하는 것입니다.

효모 표면에 나타나는 기질 분자를 탈인산화하는 능력이 처음으로 입증되었습니다. 이 발견은 이전에는 접근할 수 없었던 효소 변형의 일반화 가능한 동역학 매핑의 가능성을 열어줍니다. 이 연구는 효소 기질 상호 작용을 이해하는 것과 관련된 문제를 해결합니다. 일반적으로 이러한 유형의 평가에는 세포 용해물 또는 맞춤형 펩타이드가 필요합니다. 여기서, FasL 대안은 효모 디스플레이 기질의 사용을 통해 제공된다.

이 프로토콜은 일반적으로 세포외 공간에서 세포내 효소 반응이 될 수 있는 것을 분석하기 위해 전통적인 효모 표면 디스플레이를 발전시켜 일반적으로 평가하기 어려운 이러한 상호 작용의 FasL 분석을 가능하게 합니다.

이 프로토콜을 사용하면 처리량이 많은 방법을 통해 다양한 효소의 기질 선호도를 조사하고 간단한 판독으로 동역학 연구를 수행할 수 있습니다.

[강사] 시작하려면 준비된 효모 세포의 분취량을 얼음 위에서 해동합니다. 효모 디스플레이 구조물을 포함하는 0.5 내지 1.5마이크로그램의 플라스미드 DNA를 세포에 직접 첨가합니다. 그런 다음 0.5밀리리터의 변형 용액 또는 멸균 50% 폴리에틸렌 글리콜 및 0.1몰 리튬 아세테이트 용액을 첨가합니다. 세포, 플라스미드 DNA 및 형질전환 용액의 혼합물을 피펫팅으로 완전히 결합합니다. 형질전환 혼합물을 섭씨 30도에서 30-60분 동안 정적으로 배양하고 15분 간격으로 혼합물을 소용돌이치게 합니다. 1000G에서 원심분리하여 세포를 수확합니다. 4.5밀리리터의 플라스미드 함유 효모 세포 성장 또는 SDCAA 배지가 들어 있는 14밀리리터 배양 튜브를 준비합니다. 원하는 플라스미드를 포함하는 세포를 500마이크로리터의 SDCAA에 재현탁하고 준비된 4.5밀리리터의 배지를 접종합니다. 접종된 배양물 50밀리리터 중 50마이크로리터를 오거를 뚫지 않고 SDCAA 플레이트에 조심스럽게 분배합니다. 섭씨 30도에서 48시간 동안 정적으로 배양하여 변형 효율을 결정합니다. 이제 5밀리리터의 SDCAA 세포 배양액을 섭씨 30도 및 300RPM의 진탕 인큐베이터에서 최소 18시간 동안 배양합니다. 16시간 후에 600나노미터에서 광학 밀도를 모니터링하고 20시간 후에 다시 반복합니다. 샘플이 6을 초과하지 않는 광학 밀도에 도달하면 배양액을 2500G에서 3분 동안 원심분리하고 효모 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버립니다. 단백질 발현 유도 또는 SRGCAA 배지를 1보다 작은 600나노미터의 최종 광학 밀도로 효모 펠릿을 재현탁합니다. 효모 배양액을 섭씨 30도 및 300RPM의 진압 인큐베이터에서 최소 8시간, 24시간 이내로 배양합니다. 그런 다음 600나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 셀 밀도를 결정합니다. 1.7밀리리터 바이알에 탈이온수로 2X 작업 완충 용액을 1:2 비율로 희석하여 샘플에 대한 작업 완충액을 준비합니다. 각 샘플에 대해 200만 개의 효모 세포를 회수하는 데 필요한 적절한 양의 효모 배양액을 1.7밀리리터 바이알에 추가합니다. 바이알을 4500G에서 1분 동안 원심분리하고 마이크로 피펫을 사용하여 조심스럽게 상청액을 제거하고 생물학적 유해 폐기물로 폐기합니다. 원심분리 및 상청액 제거를 반복하기 전에 펠릿화된 세포를 PBSA 1밀리리터에 재현탁합니다. 제쳐두세요. 재조합 인간 SHP-2 용액을 총 반응 부피 20마이크로리터에서 최종 농도 1,000나노몰로 준비합니다. 다음으로, 15밀리리터 원추형 튜브에 담긴 탈이온수 10밀리리터에 7.7밀리그램의 DTT를 첨가하여 5밀리몰 DTT 용액을 만듭니다. 이제 펠릿화된 세포를 가져와 최종 반응 부피가 샘플당 20마이크로리터가 되도록 작업 완충액에 다시 현탁합니다. 0.5밀리몰의 최종 DTT 농도를 위해 각 샘플에 2마이크로리터의 5밀리몰 DTT 용액을 추가합니다. 준비된 부피의 SHP-2를 각 샘플에 추가하여 최종 부피 20마이크로리터를 달성하고 마이크로 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다. 누출이나 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 바이알 뚜껑을 파라필름으로 감쌉니다. 샘플을 섭씨 37도에서 로터에서 일정한 속도로 2시간 동안 배양합니다. 로터에서 샘플을 제거한 후 각 샘플에 1밀리리터의 PBSA를 첨가한 후 다시 1분 동안 원심분리하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 상청액을 버립니다. 펠릿화된 샘플을 해당 1차 시약의 20마이크로리터 혼합물에 다시 현탁하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 20분 후 샘플을 4500G에서 1분 동안 원심분리하고 상청액을 생물학적 유해 폐기물로 폐기합니다. 세포를 다시 원심분리하기 전에 세포를 PBSA 1밀리리터에 다시 현탁시켜 세포를 한 번 세척합니다. 이제 해당 2차 시약의 20마이크로리터 혼합물에 샘플을 다시 현탁시키고 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. 샘플을 원심분리하고 상청액을 버린 후, 세포를 PBSA로 한 번 더 세척한 후 다시 원심분리합니다. 다음으로, 세척된 샘플을 300-500마이크로리터의 PBSA에 다시 현탁시키고 유세포 분석을 위해 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 세포분석기를 준비한 후 파일을 클릭한 다음 새 실험 버튼을 클릭하고 실험 이름을 지정하고 저장을 클릭하여 획득한 데이터가 원하는 파일 경로에 저장되도록 합니다. 상단 도구 모음에서 도트 플롯 아이콘을 선택하여 각 샘플에 대해 두 개 이상의 도트 플롯을 생성합니다. 도트 플롯 중 하나의 경우 x축 이름에 FSCA 채널이 표시되고 y축 이름에 SSCA 채널이 표시되는지 확인합니다. 다른 플롯의 경우, x축 이름을 선택하여 1차 항-에피토프 태그 항체를 표적으로 하는 2차 시약이 형광을 발하는 채널을 표시하고, y축 이름을 선택하여 스트렙타비딘 2차 시약이 형광을 발하는 채널을 표시합니다. 튜브를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Edit Name을 선택한 다음 샘플 이름을 입력하여 샘플에 대한 설명이 포함된 이름을 제공합니다. 각 샘플 튜브를 세포 분석기 홀더에 넣고 실행을 클릭하여 샘플 로드 및 데이터 수집을 시작합니다. 필요에 따라 이벤트, 시간 및 유량을 조정합니다. SSCA 대 FSCA 플롯에서 건강한 효모 세포를 둘러싼 게이트를 정의합니다. 그런 다음 모든 대조군 샘플의 형광을 기록합니다. 처리된 샘플을 분석하기 전에 생성된 플롯에 대한 게이팅 전략을 정의합니다. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하기 전에 세포 분석기와 게이팅 전략을 사용하여 탈인산화 샘플의 형광을 기록합니다. 표면에 단백질을 발현하는 세포의 y축 중앙값과 샘플과 대조군 사이의 재생되지 않는 세포에 의해 제공되는 기준선 인산화를 측정하고 비교하여 인산화를 평가합니다. 마지막으로 제공된 공식을 사용하여 백분율 중앙값 인산화 차이를 계산합니다. 다양한 SHP-2 포스파타제 농도 및 배양 시간이 효모 표면에 표시된 기질의 중앙값 인산화 차이에 미치는 영향이 이 그림에 나와 있습니다. 백분율 중앙 인산화 차이는 모든 SHP-2 농도에서 시간이 지남에 따라 감소했으며, 4시간 동안 1,000나몰 SHP-2 농도에서 가장 높은 탈인산화가 관찰되었습니다. 2시간의 배양 후, 1,000나노몰 SHP-2는 약 48.8%의 중앙값 인산화 차이를 초래했으며, 이는 동일한 시점의 750나노몰 조건보다 현저히 낮았습니다. 500나노몰, 750나노몰 및 1,000나노몰 SHP-2 농도에 걸쳐 배양을 2시간에서 3시간으로 연장했을 때 중앙값 인산화 차이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다.