2025년 5월 16일
이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana 종자에서 배유 세포층의 온전한 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주사 바늘 및 정밀 겸자와 같은 일반적인 실험실 장비만 필요하며 개발 중인 종자와 성숙한 종자 모두에서 배유 세포의 고해상도 형광 라이브 셀 이미징을 가능하게 합니다.
우리의 연구 범위 중 하나는 종자 과학입니다. 우리는 배유가 종자 발아에 어떻게 기여하는지에 대한 질문에 답하는 것을 목표로 합니다. 종자 성장 억제 분석이라고 하는 시험관 내 분석은 종자 발아에서 배유의 생리학적 중요성을 밝혔습니다. 애기장대 씨앗은 매우 작으며 배유 세포층의 위치는 세포인 고환 아래에 있습니다. 화학적으로 고정하지 않고 배유 샘플을 준비하는 것은 어렵습니다. 배유 분석에 대한 이전의 분석에서는 화학적으로 고정된 샘플을 사용했기 때문에 유기체 단백질의 움직임을 관찰할 수 없었습니다. 우리의 프로토콜은 배유 세포의 역학에 대한 5개의 세포 이미징을 가능하게 합니다. 우리의 프로토콜은 표준 실험실 장비를 사용하여 수행할 수 있으며 세포간 사건 및 분자 메커니즘과 규칙적인 배유 기능에 대한 더 깊은 통찰력을 제공합니다.
[해설자] 시작하려면 개화 단계까지 토양이나 암면에서 애기장대 식물을 재배하십시오. 개화 후 0일을 나타내기 위해 색깔 있는 실로 완전히 열린 꽃을 표시하십시오. 다음 절차를 위해 개화 후 12일에서 16일 사이에 Siliques를 선택하십시오. 가는 가위를 사용하여 꽃자루에서 표시된 발달 중인 도모를 잘라 1.5밀리리터 튜브에 모으십시오. 건조를 방지하기 위해 해부용 젖은 여과지를 준비하고 샘플을 실체 현미경 아래에 놓습니다. 두 개의 집게를 사용하는데, 하나는 고정하기 위한 두꺼운 팁이 있고 다른 하나는 찢기 위한 날카로운 팁이 있습니다. 리플럼에서 밸브를 분리합니다. 그런 다음 끝이 닫힌 집게를 사용하여 siliques에서 발달 중인 씨앗을 부드럽게 집어 손상을 방지합니다. 27 게이지 주사 바늘을 사용할 때 배아를 둘러싼 고환과 배유에 약 0.1-0.2mm 크기의 흉터를 만듭니다. 씨앗을 부수지 않고 집게로 잡고 자엽과 라디칼의 접합부에 흉터를 만드십시오. 이제 집게로 씨앗을 꼬집어 배아를 밀어내고, 종자 외피가 부서지지 않도록 주의하고 둥근 모양을 유지합니다. 흉터의 빈 종자 봉투에 주사 바늘을 삽입하고 안쪽에서 바깥쪽으로 찔러줍니다. 그런 다음 바늘을 제자리에 고정하고 닫힌 끝 겸자를 사용하여 Testa의 표면을 긁습니다. 그런 다음 종자 봉투의 한쪽을 잘라 열릴 수 있도록 합니다. 이제 날카로운 끝 집게를 사용하여 종자 봉투를 시트로 엽니다. 분리된 샘플은 이제 배유와 Testa로 구성된 이중층 시트여야 합니다. 마른 애기장대 씨앗을 1.5밀리리터 튜브에 넣고 1밀리리터의 이중 증류수를 첨가합니다. 씨앗을 실온에서 최소 40분 동안 흡수하십시오. 해부를 위해 실체 현미경 스테이지에 젖은 여과지를 준비하고 1000마이크로리터 마이크로 피펫을 사용하여 흡입된 종자를 젖은 여과지에 옮깁니다. 이제 샘플을 실체 현미경 아래에 놓습니다. 주사 바늘을 사용하여 배아를 둘러싼 고환과 배유에 약 0.2mm 크기의 흉터를 만듭니다. 씨앗을 부수지 않고 집게로 잡고 흉터를 위해 자엽과 라디칼 사이의 접합부를 목표로 삼습니다. 이제 집게로 씨앗을 꼬집은 후 배아를 밀어냅니다. 빈 종자 봉투를 부수지 말고 둥근 모양을 유지하십시오. 주사 바늘을 사용하여 빈 종자 봉투의 윗면과 아래쪽을 모두 잘라 원통형 모양으로 만듭니다. 그런 다음 원통형 종자 봉투를 중심축을 따라 잘라 두 조각으로 나눕니다. 결과는 배유와 고환으로 만들어진 이중층 시트여야 합니다. 분리된 배유 샘플을 유리 슬라이드에 시트로 놓고 물에 장착합니다. 마지막으로, 배유층이 커버 슬립을 향해 위쪽을 향하도록 샘플 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 현미경으로 샘플을 관찰하기 전에 매니큐어나 그리스를 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 건조를 방지하십시오. 수많은 배유 세포와 이들의 세포내 구조는 확립된 준비 프로토콜을 사용하여 개화 후 14일에 수확된 종자로부터 성공적으로 시각화되었습니다. 배유 세포의 핵 내부에서 사진 몸체가 검출되어 백색광 하에서 PHYB-GFP를 발현하여 배유 세포의 존재와 핵 국소화를 확인했습니다. 배유 세포는 원적색광과 적색광을 번갈아 가며 노출할 때 가역적인 광체 형성을 보여 해부 후 최대 4.5시간까지 PHYB 광가역성과 생물학적 활성을 확인했습니다. 3시간의 종자 억제 후 온전한 배유 세포에서 미토콘드리아의 형광 타임랩스 이미징을 수행하고 미토콘드리아 이동을 검출했습니다. 종자 억제 1일 후 배유 세포에서 보다 역동적인 미토콘드리아 운동성이 관찰되었으며, 이는 시간이 지남에 따라 활동이 증가했음을 나타냅니다.
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이 연구는 아라비도프시스 탈리아나 종자의 염증층 세포층의 준비에 대해 탐구하며, 종자 발아에서의 중요한 역할을 밝혀냈습니다. 간단한 실험실 장비를 활용하여 개발된 프로토콜은 발달 중인 종자와 성숙한 종자의 염증층 동태에 대한 고해상도 형광 생체 세포 이미징을 가능하게 합니다.
High-resolution live-cell imaging of intact endosperm layers in Arabidopsis seeds enables direct observation of protein localization and organelle dynamics, addressing a key challenge in plant developmental biology. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery pipelines focused on seed physiology and molecular function. The protocol's reliance on standard laboratory equipment enhances accessibility and reproducibility for enterprise R&D teams.
This protocol integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target validation to preclinical model development in plant systems.