AAV2의 지주막하 주입에 의한 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입

우리의 연구는 마우스 신피질에서 대량의 신경 조직을 바이러스 형질도입할 수 있는 방법을 개발하는 데 중점을 두고 있습니다. 일반적으로 바이러스 입자의 현탁액은 뇌 실질에 직접 주입됩니다. 여기서 영역 형질감염은 제한된 범위를 가진 뇌 조직에서 바이러스 입자의 확산에 의해 결정됩니다.

AAV2 바이러스 벡터 바이러스를 뇌 표면을 통해 지주막하 공간에 주입합니다. 우리는 바이러스의 지주막하 투여가 실질내 주사에 비해 감염 면적이 거의 4배 증가한다는 것을 발견했습니다. 새로운 기술은 성인 마우스에서 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입을 제공하고 신경 활동의 후속 광학 또는 전기생리학적 기록을 위해 뇌 조직을 보존하는 데 도움이 됩니다.

우리의 주입 방법은 강력한 비선택적 프로모터를 사용하는 경우에도 대규모 집단 층 5개의 피라미드 뉴런에서 이식유전자의 선택적 발현을 허용합니다. 그러나 이러한 선택성의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 시작하려면 마취된 쥐의 앞니를 치아 막대에 고정하고 동물 마스크를 장착합니다.

이어바에 마우스를 조심스럽게 놓습니다. 눈에서 귀 뒤까지 머리를 면도한 다음 면도한 표면을 70% 에탄올로 면봉으로 닦은 다음 5% 알코올 요오드 용액으로 면봉으로 닦습니다. 멸균 4% 리도카인 용액을 국소적으로 바르고 덱사메타손 0.02밀리리터를 피하 주사하여 통증과 염증을 줄입니다.

멸균 메스와 가위를 사용하여 귀 사이에서 시작하여 4-5mm 정중선을 절개하여 두피를 엽니다. 두개골 손상을 방지하기 위해 가위를 사용하여 절개 부위를 확장하십시오. 두개골 표면을 3% 과산화수소로 면봉으로 닦아 브레그마와 람다를 시각화합니다.

즉시 0.9% 염화나트륨 식염수로 반응을 중지하십시오. 그런 다음 뼈 스크레이퍼를 사용하여 두개골 표면에서 조직을 제거합니다. 미리 준비된 전동 인젝터를 Hamilton 주사기로 정위 고정 암에 장착합니다.

수술용 광원을 사용하여 노출된 두개골을 비추고 현미경을 브레그마에 초점을 맞춥니다. 현미경을 통해 정위 암을 조작하여 바늘 끝을 브레그마 바로 위에 정렬합니다. 바늘 끝을 사용하여 브레그마와 람다를 수평으로 정렬합니다.

bregma로 돌아가서 좌표를 기록하십시오. 바늘을 계산된 좌표로 이동합니다. 새 위치로 내리고 표시하십시오.

바이러스 확산을 고려하면서 표적 근처에서 바이러스 주입 부위를 선택합니다. 이제 직경 0.5-0.8mm의 멸균 치과용 버를 사용하여 현미경을 통해 관찰하면서 작은 개두술을 만듭니다. 가압 공기를 사용하여 뼈 가루를 날려버립니다.

멸균 식염수로 구멍을 목욕시키고 면봉으로 초과분을 제거하십시오. 그런 다음 갈고리 모양의 끝이 달린 27게이지 바늘이나 가는 핀셋을 사용하여 경막이 손상되지 않도록 주의하면서 남은 뼈를 제거합니다. 멸균 식염수에 적신 종이 타월로 두개골을 덮습니다.

그런 다음 두개골 표면 위에 멸균 투명 필름을 놓습니다. 정위 암을 뒤로 움직이고 마이크로 주사기 바늘을 투명 필름 위에 맞춥니다. 그런 다음 2마이크로리터가 남을 때까지 여분의 오일을 분배합니다.

바이러스 주입량과 또 다른 2마이크로리터의 바이러스를 투명 필름에 피펫팅합니다. 현미경을 통해 바늘 끝을 바이러스 방울의 중앙으로 내립니다. 이제 전동 인젝터를 사용하여 마이크로 주사기에 바이러스를 로드합니다.

두개골에서 젖은 종이를 제거하고 면봉으로 해당 부위를 말립니다. 정위 고정 팔과 바늘을 삽입 부위 위에 재배치합니다. 그런 다음 바이러스 한 방울을 분배하여 바늘 막힘 여부를 확인합니다.

끝이 갈고리 모양인 30게이지 바늘을 사용하여 경막에 작은 슬릿을 만듭니다. 주사기 바늘을 경막까지 내리고 표면 접촉점을 기준으로 삽입 깊이를 계산합니다. 바늘을 피질에 300마이크로미터 깊이까지 천천히 삽입하고 2-3분 동안 기다렸다가 200마이크로미터로 집어넣은 후 2-3분 더 기다립니다.

총 1마이크로리터에 대해 분당 0.06마이크로리터로 바이러스 주입을 시작합니다. 주입 후 바늘을 표적 부위에 10분 동안 유지하여 바이러스가 분산될 수 있도록 합니다. 그런 다음 역류를 방지하기 위해 바늘을 천천히 집어넣습니다.

바늘이 막히지 않았는지 확인하기 위해 바이러스 한 방울을 분배합니다. 5-0 흡수성 또는 비흡수성 봉합사를 사용하여 두피 절개 부위를 봉합합니다. AAV2의 지주막하 투여는 기존의 피질내 주사에 비해 훨씬 더 큰 신경 감염 영역을 초래했으며 내외측 및 주꼬리 방향 모두에서 거의 4배 확장되었습니다.

지주막하 바이러스 주사는 피질층 2, 3, 5층의 뉴런에 강한 녹색 형광 표지를 초래한 반면, 4층과 6층은 표지된 세포체를 나타내지 않았지만 각각 눈에 보이는 수상돌기와 축삭을 나타냈습니다. 지주막하 주사 중 주입된 바이러스 현탁액에 첨가된 형광 입자가 뇌 표면을 따라 발견되었으며, 이는 바이러스가 뇌척수액을 통해 퍼져 있음을 나타내며 신경 표지보다 표면 범위가 더 넓습니다. 전두엽 절편에서 녹색 형광의 큰 표면 분포는 표준 주사에서 볼 수 있는 작은 국소 감염과 달리 지주막하 주사 후 광범위한 피질 감염을 확인했습니다.

초입상 층에서는 형질도입된 뉴런의 상당 부분이 파르브알부민 또는 칼빈딘을 공동 발현한 반면, 5층에서는 공동 표지된 중간 뉴런이 검출되지 않았으며 모든 감염된 세포는 피라미드 뉴런으로만 대표되었습니다.