세포의 표적 밀링을 위한 극저온 일치 형광, 전자 및 이온빔 현미경을 사용한 워크플로
2025년 10월 17일
이 워크플로우는 극저온 삼중 일치 이미징 플랫폼을 사용하여 작고(축 범위 <1μm) 희귀한(세포당 1개 사본) 형광 표지된 생물학적 구조를 표적으로 하는 라멜라 생산을 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 형광 현미경, 집중 이온 빔 밀링 및 스캐닝 전자 현미경을 단일 초점 위치에 통합하고 밀링 중 동시 형광 현미경을 가능하게합니다.
저의 연구는 집중 이온 빔 밀링 중 극저온 라멜라의 세포 특징을 보존하는 광학 현미경 방법을 개발하여, 극저온 전자 단층촬영을 통한 정밀 분석을 통해 자연 생물학적 조직을 밝혀낼 수 있게 합니다. 광학 현미경은 CryoFIB-SEM 시스템에 통합되었으나, FIB와 같은 위치에서 사용되는 경우는 드뭅니다. 이는 최종 라멜라에서 형광 표지된 표적을 보존하기 위해 등록 기반 가이드 접근법을 필요로 합니다.
먼저, 단계가 극저온 상태에 도달하면 액체 질소를 사용해 수동으로 전이 스테이션을 냉각하세요. 클립된 오토그리드 하나를 극저온 광학 현미경 시스템용으로 설계된 샘플 카세트에 적재합니다. 오토그리드가 접착된 커버 슬립과 스페이서 사이에 위치하도록 하세요.
링 스크류를 조여 카세트를 닫고 전송 스테이션의 슬롯에 삽입하세요. 전송 스테이션을 극저온 광학 현미경 시스템에 연결하세요. 내부 챔버 카메라를 사용해 샘플 카세트를 샘플 스테이지로 안내합니다.
광학 현미경 소프트웨어에서 시료 단계를 로딩 위치에서 미리 정의된 3빔 위치로 이동시킵니다. FIB-SEM 소프트웨어에서 배율을 100배로 설정하고 왼쪽 상단 창을 클릭하세요. 광학 현미경 소프트웨어의 정렬 탭에서 Z를 클릭하고 재생 기능을 선택하여 그리드의 SEM 아틀라스를 획득합니다.
손상된 탄소 필름이 있는 정사각형 영역을 찾아 더블 클릭하면 샘플 단계를 그 위치로 옮깁니다. 소프트웨어 인터페이스로 돌아가세요. FIB를 활성화하고 영상을 확보하세요.
왼쪽 상단의 드롭다운 메뉴를 이용해 배율을 조절하세요. 재생 버튼을 눌러 FIB 이미지를 표시합니다. 그 다음 슬라이드 바를 이용해 스텝 크기를 설정하세요.
이제 Z와 Z를 클릭해 이온과 전자 이미지의 수평선이 같은 특징과 일치할 때까지 단계 Z 위치를 조정하세요. 광학 현미경 소프트웨어에서 SEM 탭을 선택하세요. 또는 X와 Y 버튼을 사용해 SEM과 이온 이미지 사이의 공통 특징을 정렬하세요.
이제 형광 현미경을 켜세요. FLM 탭을 선택하고 반사광 영상 조건을 설정한 후 재생을 선택하세요. 그 다음 반사된 빛 이미지를 SEM 이미지와 정렬합니다.
이미지를 확대하고 직사각형 옵션을 클릭하여 이온 빔의 밀링 패턴을 정의하세요. 디스플레이 2에서 '패터닝 시작'을 눌러 집중된 이온 빔을 사용해 작은 패턴을 밀링합니다. 밀링 패턴이 집축된 이온 빔과 형광 현미경 모두에서 보이는지 확인하세요.
광학 현미경 소프트웨어에서 '위치 조절' 탭으로 이동하여 적절한 조건을 활성화하여 형광 채널을 설정하세요. 각 형광체를 별도의 채널에 할당하고, 밝은 영역을 위한 추가 채널을 추가하세요. 각 형광 채널의 LED 출력과 노출 시간을 조정하여 관심 있는 타겟을 식별하세요.
매개변수가 만족스럽게 되면, 축방향을 따라 단계적으로 진행하여 미리 밀링된 형광 z-스택을 획득합니다. 그 다음 목표물을 관심 지역으로 표시하세요. FIB-SEM 소프트웨어로 전환하여 관심 영역에 라멜라를 그리세요.
형광 현미경을 켜 신호 변화를 모니터링하는 동안 벌크 재료를 제거하기 위해 러프 밀링을 수행합니다. 단말기에서 파이썬 기반 간섭계 툴킷을 열어 라멜라 얇아질 때 형광 신호를 모니터링합니다. 청소 단면 모드를 사용해 ROI를 약 2마이크로미터로 희석합니다.
축 방향 범위가 300나노미터를 초과하는 타겟의 경우, 파이썬 GUI에서 형광 현미경에서 타겟을 선택합니다. 소프트웨어는 새로운 프레임마다 시간에 따라 밝기를 자동으로 그래프로 표시하기 시작합니다. 파이썬 툴킷을 통해 형광 강도를 모니터링하세요.
샘플을 세척 단면 모드로 밀링하여 관심 영역 아래의 남은 지지막을 제거합니다. 형광 강도가 갑자기 떨어지는 것을 관찰하여 밀링 방향을 전환하는 신호를 주세요. 아래에서 밀링할 때 급격한 감소가 관찰되면 멈추고 위에서 아래로 밀링을 시작하세요.
상향식 밀링을 마친 후, 원하는 두께에 도달할 때까지 아래에서 위로 세척 단면 모드로 밀링하여 라멜라를 마무리합니다. 그 후 밀링 후 라멜라의 형광 이미지를 촬영합니다. 샘플을 CryoTEM으로 옮기세요.
포스트 밀링 다중 채널 형광 이미지와 CryoTEM 투사 이미지를 관심 영역 등록을 위해 맞춤형 사영 변환 소프트웨어에 로드합니다. 이제 형광 및 전자현미경 이미지에서 모두 보이는 기준점 쌍 8개에서 10개를 선택하여 사영 변환을 계산합니다. 겹쳐진 이미지를 참고하여 영상 영역을 선택하세요.
그 후 타겟 구조의 크기와 원하는 해상도에 따라 틸트 시리즈에 적합한 배율 및 획득 매개변수를 선택하세요. SiR-튜불린으로 표지된 분화 대식세포는 약 1마이크로미터 직경의 단일 밝은 형광 지점을 나타냈으며, 이는 MTOC에 해당하며, 미세소관 네트워크와 일치하는 섬유근육통 유사 구조가 세포 말초로 방사되어 있었습니다. 시료를 약 800나노미터 두께로 밀링하면서, 단일 형광 MTOC 구멍은 각각 약 700나노미터 직경의 두 개의 뚜렷한 점으로 분리되었습니다.
비형광성 벌크 물질과 흡수 지지막을 제거한 후 형광 강도가 증가했으며, 층층이 2마이크로미터에서 200나노미터 이하로 더 얇아지면서 급격히 감소했습니다. 상관된 극저온 형광과 전자현미경을 통해 밀링 과정에서 구조의 정밀한 표적 지정이 가능해졌습니다. 재구성된 단층촬영술과 분절 모델 결과, 중심립체는 미세소관 3중항으로 구성되어 있음을 알 수 있습니다.
최종 라멜라에 하나의 형광 반점만 남아 있는 경우, 해당 단층촬영술에서 단일 중심립이 확인되었습니다. 밀리밀링을 기반으로 한 형광의 정확도는 회절 제한 해상도, 굴절률 불일치, 그리고 밀링에 의한 운동 등 등록 방식에 의해 제한됩니다. 동시 광학 현미경과 FIB 밀링은 형광 현미경의 실시간 피드백을 이용해 밀링 과정을 안내하여 등록 오류를 제거합니다.
이로 인해 회절 한계와 굴절률 불일치로 인한 오류를 피하여, 최종 라멜라 내에서 형광 표지된 구조를 보존하여 냉동 전자 단층촬영을 위해 정밀하게 밀링할 수 있습니다. 우리의 연구는 이전에는 냉동절계로 직접 시각화하기 어려웠던 세포 구조를 관찰할 수 있게 하여, 다양한 주요 미세분자 기계 뒤에 숨겨진 분자 메커니즘을 밝혀냅니다.
개요
이 워크플로우는 작고 드문 형광 표지된 생물학적 구조를 타겟팅하는 극저온 라멜라 생산을 가능하게 합니다. 단일 초점 위치에서 형광 현미경, 집중 이온 빔 밀링 및 주사 전자 현미경의 통합으로 동시 이미징 및 밀링이 가능합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 신경과학
- 생물물리학
- 현미경 기술
배경
- 광학 현미경 방법은 밀링 중 세포 특징을 보존하는 데 필수적입니다.
- CryoFIB-SEM 시스템에 형광 현미경 통합은 드뭅니다.
- 형광 표지된 타겟을 유지하기 위해 등록 기반 안내가 필요합니다.
- 세부 분석을 위해 원래의 생물학적 조직을 이해하는 것이 중요합니다.
연구 목적
- 극저온 라멜라에서 세포 특징을 보존하는 방법을 개발합니다.
- 극저온 전자 단층 촬영을 통한 세부 분석을 가능하게 합니다.
- 밀링 중 형광 구조의 타겟팅 정확도를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 액체 질소를 사용한 전송 스테이션의 수동 냉각.
- 형광 현미경과 FIB-SEM 시스템의 통합.
- 밀링 전 형광 z-스택의 획득.
- 파이썬 툴킷을 사용한 밀링 중 형광 강도 모니터링.
주요 결과
- 형광이 없는 벌크 물질을 제거한 후 형광 강도가 증가했습니다.
- 상관된 극저온 형광 및 전자 현미경을 통해 정확한 타겟팅이 가능했습니다.
- 재구성된 단층 촬영은 중심체의 구조를 보여주었습니다.
- 일부 경우 단일 중심체 시각화가 달성되었습니다.
결론
- 이 연구는 극저온 라멜라 생산의 효과적인 방법을 보여줍니다.
- 형광 기반 타겟팅은 구조 분석의 정확도를 향상시킵니다.
- 이미징 기술의 통합은 생물학적 조직의 이해를 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Simultaneous cryogenic fluorescence, electron, and ion beam microscopy enables precise, real-time targeting of rare cellular structures during lamella preparation for cryo-electron tomography. This workflow eliminates registration errors and enhances the preservation of disease-relevant subcellular features, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking. The approach supports higher predictive confidence in structural biology pipelines and facilitates risk-adjusted portfolio decisions for complex biological targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and preservation of fluorescently labeled subcellular targets during sample preparation.
- Reduces ambiguity in mechanistic studies by maintaining structural integrity of rare or small features.
- Improves predictive confidence for target validation by correlating fluorescence with ultrastructural data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lamellae for downstream high-resolution imaging and quantitative analysis.
- Supports reproducible sample preparation by integrating real-time fluorescence feedback during milling.
- Facilitates standardization of workflows for screening rare cellular events or phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural preservation with translational biomarker discovery when fluorescent labels mark disease-relevant features.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting correlative imaging strategies.
- De-risks advancement decisions by providing high-fidelity structural data on targets of interest.
Pipeline & Workflow Integration
This tri-coincident imaging workflow integrates at the interface of discovery biology and structural analysis, bridging early target validation with preclinical model characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of labeled structures during milling.
- Screening: Provides reproducible, quantitative lamella preparation for downstream imaging assays.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence intensity measurements to guide and document sample processing.
- Translational Research: Maintains alignment between molecular labeling and ultrastructural readouts for biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for targeting diverse cellular structures across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of lamella preparation for high-resolution imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust structural data on rare targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on direct structural evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic microscopy, fluorescence imaging, and focused ion beam operation.
- Demands integrated instrumentation capable of simultaneous tri-modal imaging and milling.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and sample handling protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or labeling strategies.
- Practical limitations include fluorescence signal stability and potential milling-induced motion artifacts.
