Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

우리는 복합 거대 단층 소포의 합성 및 전기 유체역학에 대한 정교한 연구를 수행하여 진핵 세포의 생체자기 등가물로 확립했습니다. 이 시도는 세포 전기천공 및 세포 전기변형과 같은 생물학적 세포에 전기장을 적용하는 기술을 이해하는 것입니다.

형광 및 광학 현미경, 나노초 펄스 전기 처리, 오실로스코프 및 전원, 혁신적인 합성 방법의 조합이 이 분야의 연구를 발전시키기 위해 사용됩니다. 온도, 지질 유형 및 사용된 조성물에 대한 방법의 민감도에서 잘 형성된 화합물 GUV의 합성에 대한 과제. 이 작업에서 우리는 DMPC 및 콜레스테롤 시스템에 대해 이를 입증하지만 이를 일반화하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 핵 세포를 모방하는 간단한 GUV가 문헌에서 합성되었습니다. 우리는 판막 방어 구조를 가진 유핵 세포를 모방하기 위해 복합 거대 소포를 합성하여 외부 소포 크기의 약 절반 크기의 내부 소포를 둘러싸고 있습니다.

우리는 전기천공의 맥락에서 생물학적 세포의 핵을 모방하는 내부 소포에 대한 마이크로 및 나노초 펄스의 효과를 연구하는 데 중점을 둘 것입니다.

[해설자] 시작하려면 주방세제 용액을 사용하여 산화인듐주석 또는 ITO 코팅 슬라이드를 철저히 세척하고 전도도가 센티미터당 0.055마이크로지멘스인 탈이온수로 헹굽니다. 그런 다음 100% 에탄올 용액을 사용하여 슬라이드를 다시 세척하고 탈이온수로 헹굽니다. 섭씨 85도로 설정된 오븐에서 슬라이드를 건조시킵니다. 클램프 미터를 사용하여 각 ITO 코팅 슬라이드의 전도성 측면을 식별합니다. 진공청소기를 사용하여 깨끗한 슬라이드를 스핀 코더 스테이지에 고정하고 전도성이 위쪽을 향하도록 합니다. 25마이크로리터의 지질 용액을 1개의 ITO 슬라이드의 전도성 면에 4개의 물방울을 도포합니다. 다른 슬라이드를 가져와 같은 방식으로 25마이크로리터의 지질 용액을 두 번 도포합니다. 두 지질 코팅 슬라이드를 데시케이터에서 최소 2시간 동안 진공 건조시킵니다. 그런 다음 지질 코팅된 ITO 슬라이드를 깨끗한 슬라이드와 평행하게 배치하여 전도성 면이 서로 마주보도록 하고 그 사이에 3mm 두께의 실리콘 고무 스페이서를 배치합니다. 클램프로 설정을 밀봉하여 전기 주조 챔버를 만듭니다. 이제 2밀리리터 주사기를 사용하여 챔버를 100밀리몰 자당 용액으로 채웁니다. 함수 발생기의 출력 케이블을 함수 발생기가 있는 ITO 코팅 슬라이드에 연결합니다. 섭씨 38도에서 40도 사이로 유지되는 인큐베이터에 두 전기 주조 챔버를 놓습니다. 듀얼 채널 함수 발생기를 사용하여 10Hz 주파수에서 5볼트 피크 투 피크의 교류 전기장을 4시간 동안 적용합니다. 배양 후 함수 발생기에서 전기 주조 챔버를 분리합니다. 인큐베이터에서 꺼내 실온으로 식히십시오. 주사기를 사용하여 각 챔버에서 합성된 거대한 단층 소포를 수확하여 별도의 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 삼투압 쇼크를 진행하기 전에 섭씨 25도에서 27도 사이의 실온에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다. 100밀리몰 자당 용액이 포함된 수화 배지에 현탁된 단순 거대 단층 소포(sGUV) 200마이크로리터를 관찰 챔버로 옮기고 125마이크로리터의 300밀리몰 포도당 용액을 도입하여 삼투압 충격을 유도하고 모양 전이를 시작합니다. 현재 삼투압 쇼크를 겪고 있는 sGUV를 현미경 스테이지에 배치된 관찰 챔버 내부에서 1시간 동안 휴식을 취하도록 합니다. 단색 카메라가 장착된 도립 현미경을 사용하여 미분 간섭 대비 및 낙산화 형광 현미경을 수행합니다. Plan Fluor 초장거리 20X 0.45 및 40X x 0.60 대물렌즈를 사용하여 sGUV의 형상 전이를 관찰합니다. epifluorescence의 경우 510 - 560 나노미터에서 여기가 있는 녹색 필터 세트, 575 나노미터에서 이색성 거울, Niall Red 염색 이중층의 경우 590 나노미터에서 배리어 필터를 사용합니다. Plan Fluor 대물 렌즈와 함께 미분 간섭 대비 및 낙광 형광 현미경을 사용하여 관찰 챔버 내의 형상 전이를 모니터링합니다. 모양 전이가 진행됨에 따라 구내세포 소포의 형성을 관찰하십시오. 더 큰 소포가 먼저 정착한 다음 시간이 지남에 따라 더 작은 소포의 수가 증가하는 방식을 모니터링합니다. 다음으로, 삼투압 충격을 유도하기 전에 염 용액을 첨가하여 cGUV의 다른 영역에서 전도도를 조정합니다. 예를 들어, 환형 영역보다 외부 및 내부 영역에서 더 높은 전도성을 생성하려면 200마이크로리터의 자당 용액을 전기융합 챔버로 옮깁니다. 20마이크로리터의 7.5밀리몰 염 용액을 챔버에 넣고 125마이크로리터의 300밀리몰 포도당 용액으로 삼투압 충격을 유도합니다. 삼투압 충격 sGUV를 챔버에서 3-4시간 동안 그대로 둡니다. 생성된 cGUV가 환형 영역에 비해 외부 및 내부 영역에서 더 높은 전도성을 갖는지 확인합니다. cGUV의 전기 변형을 수행하려면 와이어 전극을 500마이크로미터 간격으로 두고 함수 발생기를 사용하여 100kHz에서 7.5볼트 피크 투 피크의 교류 전위를 적용합니다. 전기장을 가한 후 초당 10프레임으로 비디오를 캡처하고 외부 소포의 편평한 변형과 내부 소포의 변형을 관찰합니다. 그런 다음 cGUV 혼합물을 캐비티 슬라이드에 넣고 커버 슬립으로 밀봉하여 움직이지 않도록 합니다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 1마이크로미터의 스텝 크기로 Z축 스캐닝을 통해 cGUV 형태를 분석합니다. 이미징을 위해 Plan Apochromat 40X x 1.3 오일 DIC 대물 렌즈를 사용합니다. 561나노미터 여기와 561 - 695나노미터 방출의 적색 단일 채널 모드를 사용하여 Niall Red 또는 Rhodamine PE로 염색된 cGUV를 이미지화합니다. 를 수정하고 추출합니다. 현미경 연결 소프트웨어를 사용한 CZI 이미지 파일. 축척 막대와 같은 그래픽을 삽입하고 2D 및 3D 보기를 활성화합니다. 그런 다음 처리 방법 및 매개변수로 이동하여 원하는 설정을 조정합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 이미지를 JPG 형식으로 내보냅니다. 마지막으로 ImageJ 소프트웨어에서 파일을 엽니다. 축척 막대를 삽입하려면 분석으로 이동한 다음 보정할 배율 설정으로 이동한 다음 분석을 선택한 다음 도구 및 축척 막대를 선택하여 적용합니다. 공초점 Z-스택 이미징은 내부 소포가 외부 소포에서 완전히 분리되고 내부 용액의 밀도가 낮기 때문에 Z 평면에서 상승한 것을 확인했습니다. 중간 기내세포 상태는 완전히 분리되기 전에 내부 소포와 외부 소포를 연결하는 좁은 목을 보였습니다. 삼투압 쇼크 후 6시간 후에 여러 개의 내부 소포, 별 모양의 몸체, 관형 구조를 포함한 다양한 소포 형태 집단이 관찰되었습니다. 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린과 콜레스테롤의 지질 혼합물을 63 내지 37몰 비율로 사용하여 높은 양의 cGUV가 형성되었습니다. 교류 전기장 하에서 cGUV는 외부 소포가 편평한 모양을 형성하고 내부 소포가 프레이트 모양을 형성하는 변형을 보였습니다.