<em>In Vivo</em> Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Trigeminal Ganglia

John Shannonhouse; Hyeonwi Son; Yan Zhang; Eungyung Kim; Deoksoo Han; Ruben Gomez; Joon Tae Park; Yu Shin Kim

doi:10.3791/68284

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

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Neuroscience

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In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Trigeminal Ganglia

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

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07:55 min

August 1, 2025

DOI: 10.3791/68284-v

John Shannonhouse^1,2, Hyeonwi Son^1,2, Yan Zhang^1,2, Eungyung Kim^1,2, Deoksoo Han^1,2, Ruben Gomez^1,2, Joon Tae Park^2,3, Yu Shin Kim^1,2,4

¹Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry,University of Texas Health Science Center at San Antonio, ²Department of Endodontics, School of Dentistry,University of Alabama at Birmingham, ³Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering,Incheon National University, ⁴Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences,University of Texas Health Science Center at San Antonio

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study provides a detailed protocol for in vivo GCaMP calcium imaging of intact trigeminal ganglion (TG) neurons, focusing on the neural activation and responses to stimuli. The protocol includes surgical preparation, imaging techniques, and data analysis, enabling researchers to observe calcium transients in response to various sensory stimuli directly in vivo.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Calcium Imaging
Neurophysiology

Background

The trigeminal ganglion plays a crucial role in sensory perception, including pain, itch, and touch.
Studying neural networks in vivo is crucial yet challenging due to the complexity of physiological conditions.
Current research techniques often fail to capture the dynamic responses of neurons in real-time.
In vivo GCaMP imaging provides insights into neural activation at the population level during stimulation.

Purpose of Study

To develop a protocol for visualizing calcium transient activities in TG neurons during sensory stimulation.
To analyze how neurons respond to different types of stimuli.
To complement existing behavioral and cellular techniques with real-time imaging data.

Methods Used

In vivo calcium imaging using GCaMP in anesthetized mice.
Targeted dissection and exposure of the trigeminal ganglion for imaging.
Application of various stimuli (mechanical, thermal) during imaging sessions.
High-speed and high-resolution confocal microscopy protocols for capturing neuronal activity.
Data analysis includes ROI selection, intensity measurement of calcium transients, and statistical comparisons of neuron responses.

Main Results

The technique enabled visualization of spontaneous and stimulus-evoked calcium transients across V2 and V3 regions of the TG.
Higher intensity of calcium responses was recorded with increased mechanical stimulation.
Distinct neuronal activation patterns were observed with noxious thermal stimuli, revealing differences based on stimulation type and location.
Findings provide insights into the sensory processing mechanisms at the level of individual neurons within sensory ganglia.

Conclusions

This protocol advances the understanding of neuronal responses to sensory stimuli in vitro, highlighting the importance of in vivo imaging techniques.
The data collected can inform future investigations into pain mechanisms and sensory processing.
Overall, the study illustrates how advanced imaging can elucidate the roles of trigeminal neurons in sensory perception.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of this GCaMP imaging protocol?

This protocol allows for real-time observation of calcium dynamics in intact TG neurons, offering insights into sensory processing that are difficult to achieve with traditional methods.

How is the trigeminal ganglion accessed for imaging?

A surgical procedure is performed involving a cranial opening to properly expose the trigeminal ganglion without damaging surrounding tissue.

What types of stimuli are used during imaging?

The protocol includes mechanical stimuli via Von Frey filaments and thermal stimuli by applying heat or cold to specific regions.

What kinds of data can be obtained using this method?

Researchers can obtain data on calcium transients, spontaneous activity, and neuronal responsiveness to different types of sensory stimuli.

Can this method be adapted for other sensory ganglia?

Yes, the protocol can potentially be adapted for imaging other sensory ganglia, supporting broader studies on sensory processing.

What are the limitations of this imaging technique?

Challenges include maintaining physiological conditions during anesthesia and potential variations in response due to individual animal differences.

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

이 연구는 통증, 가려움증 및 촉각과 관련된 신호와 세포간 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 말초 신경절 신경망에 중점을 둡니다. 뉴런은 자극을 감지하지만 정상적인 생리적 조건에서 생체 내 활동을 연구하는 것은 여전히 매우 어렵습니다. 우리의 프로토콜은 자극에 대한 반응으로 집단 수준에서 직접 삼차신경절 신경 활성화를 연구할 수 있게 하는데, 이는 생리학적으로 중요하지만 기술적으로 매우 어렵습니다.

이 프로토콜에 의해 생성된 데이터는 행동, 세포 배양 및 면역조직화학 데이터를 강력하게 보완하는 역할을 하여 전체 신경절에 대한 자극 또는 약물의 즉각적인 영향을 조사할 수 있습니다. 시작하려면 마취된 마우스를 가열 패드 위에 올려 체온을 섭씨 37도로 유지한 다음 왼쪽으로 약 15도 기울어진 정위 마스크에 머리를 놓습니다. 건조함과 자극을 방지하기 위해 눈에 안용 연고를 바르십시오.

쥐의 머리 오른쪽을 면도한 후 오른쪽 귀와 오른쪽 눈 사이에 9mm x 5mm의 직사각형 절개를 합니다. 두개골 표면의 조직을 눈 바로 복쪽으로 자릅니다. 지혈 면봉이나 실험실 물티슈를 사용하여 출혈을 멈춥니다.

치과용 드릴과 테이퍼 열구 버를 사용하여 절개 부위를 중심으로 등쪽 두개골에 약 9mm x 5mm 크기의 구멍을 뚫습니다. 삼차신경절이 명확하게 보일 때까지 머리를 기울입니다. 삼차신경절에 출혈이 있는 경우 혈액을 흡인하거나 지혈 면봉이나 실험실 물티슈를 사용하여 혈액을 제거하십시오.

피질 조직을 제거하지 않고 삼차신경절이 명확하게 보이는지 확인하십시오. 동물과 가열 패드를 현미경 스테이지로 옮깁니다. 마우스가 지속적인 이소플루란 마취를 받는 것을 확인한 후, 현미경의 대물렌즈가 두개골 개구부 바로 위 9mm가 되도록 정위 고정 프레임을 배치합니다.

직장 체온계를 삽입하고 전원 코드를 온도계와 가열 패드에 연결합니다. 5X 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 삼차신경절의 표면을 찾습니다. 대물렌즈와 노즈 콘을 조정하여 신경절 표면을 평평하게 하고 초점면의 표면적을 최대화합니다.

이제 주어진 현미경 고속 스캐닝 프로토콜을 로드합니다. 삼차신경절을 6-8주기의 짧은 버스트로 스캔합니다. 스캔의 직교 투영을 적용하여 동영상을 만들고 프레임 간의 이미지 선명도와 일관성을 확인합니다.

현미경 고해상도 스캐닝 프로토콜을 로드하고 삼차신경절의 고해상도 이미지를 생성합니다. 다시 직교 프로젝션 동영상을 생성하고 80주기 동안 자발적인 활동을 기록하는 데 사용되는 고속 스캐닝 프로토콜을 로드합니다. 동영상을 만들고 이미지가 분석하기에 충분히 선명하고 일관성이 있는지 확인합니다.

자극을 가하려면 현미경을 15-20주기 동안 스캔하도록 설정하십시오. 삼차신경절의 V2 영역을 표적으로 하는 Von Frey 자극의 경우 필라멘트를 잡고 스캔 5 직후부터 스캔 10 직후까지 눈 아래와 입 위의 동측 부위에 반복적으로 적용합니다. V3 영역 자극의 경우 동일한 스캐닝 창 동안 귀 바로 아래의 동측 영역에 필라멘트를 반복적으로 적용합니다.

차갑고 열적인 자극의 경우 물이 담긴 비커를 원하는 온도보다 약간 낮거나 높게 식히거나 가열하십시오. 스캔을 시작하고 스캔 5 직후 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 V2 영역의 경우 눈 아래와 입 위 또는 V3 영역의 경우 귀 바로 아래에 열 자극을 가합니다. 실험이 끝나면 50밀리몰 염화칼륨을 V2 또는 V3 영역에 피하 주입하여 주기 6부터 시작하여 활성화하고 모든 반응 뉴런을 식별합니다.

직교 투영 파일을 분석 소프트웨어로 끌어다 놓아 엽니다. 이미지를 클릭한 다음 유형을 클릭하고 RGB 색상을 선택하여 이미지 유형을 선택합니다. ROI 관리자를 열려면 분석을 클릭한 다음 도구를 클릭하고 ROI 관리자를 선택합니다.

도구 모음의 타원 도구를 사용하여 ROI를 그려 활성 뉴런을 선택합니다. ROI 관리자 창에서 추가 버튼을 클릭하여 선택한 각 영역을 ROI 파일에 추가합니다. 이제 분석으로 이동하여 측정 설정을 선택하고 평균 회색 값 옵션을 선택합니다.

ROI 관리자 창에서 자세히를 클릭한 다음 다중 측정을 선택하여 강도를 측정합니다. 결과라는 새 창이 열리면 파일, 다른 이름으로 저장을 차례로 선택하여 CSV 파일을 저장합니다. 스프레드시트 소프트웨어에서 CSV 파일을 열고 스프레드시트 파일로 저장합니다. 주어진 방정식을 사용하여 칼슘 과도 강도를 계산합니다.

분석을 위해 각 신경절에서 거의 동일한 수의 뉴런을 무작위로 샘플링하여 하나의 신경절이 분석을 지배하지 않도록 합니다. 도구 모음의 선 도구를 사용하여 각 뉴런의 가장 긴 직경과 가장 짧은 직경을 따라 선을 그려 뉴런 직경을 측정합니다. 그런 다음 해당 측정값의 평균을 계산합니다.

삼차신경절의 공초점 이미징은 3, 000개 이상의 뉴런을 동시에 시각화할 수 있게 하여 V2 및 V3 영역에 걸쳐 자발적 및 자극 유발 칼슘 일시성을 모두 포착했습니다. 자극이 없는 경우, 이러한 뉴런의 하위 집합은 개별적으로 추적된 6개의 세포에 걸쳐 뚜렷한 활동 프로필을 가진 자발적인 칼슘 일시를 나타냈습니다. 상악 부위에 유해한 열을 가하면 칼슘 일시적인 강도가 동시에 증가하는 밝은 형광으로 표시되는 바와 같이 여러 뉴런이 눈에 띄게 활성화되었습니다.

하악 부위에 가해지는 유해한 열은 개별 세포에 걸쳐 다양한 형태의 칼슘 반응을 가진 별개의 뉴런을 유사하게 활성화했습니다. V2 영역의 0.4g에 비해 훨씬 더 많은 수의 뉴런이 2g Von Frey 자극에 반응했습니다. 개별 뉴런의 칼슘 일시적 강도는 0.4g보다 2g 자극에서 더 강하게 증가했으며 피크가 더 높고 반응 확산이 더 넓었습니다.

첫 번째 자극 프레임 동안의 평균 칼슘 반응 강도도 0.4g에 비해 2g 자극 후 유의하게 더 컸습니다.

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