섬유증을 동반한 대사성 기능 장애 관련 지방성 간 질환의 마우스 모델

저희 연구에서는 대사 기능 장애 관련 스테아토틱 간 질환(MASLD)과 특히 지질 축적 및 섬유화의 기전에 집중합니다. 최근 발전으로는 단세포 및 특수 전사체학, MASLD 동물 모델의 표준화, MASLD 치료용 세마글루타이드 승인 등이 있습니다. MASLD에 대한 동물 모델이 많지만, 많은 모델이 간 섬유증을 유발하지 않는다는 사실을 발견했습니다.

그래서 그 점을 해결하기 위해 MASLD의 마우스 모델을 개발했습니다. 우리 마우스 모델은 과식성 쥐에게 평균 미국식 식단과 유사한 식단을 먹여 섬유증이 동반된 MASLD를 유도합니다. 이로 인해 인간의 질병과 매우 유사한 MASLD가 발생합니다.

이 방법은 MASLD의 병태생리학 연구와 새로운 치료법 시험을 촉진할 것입니다. 우선, 슬라이드에 파라핀이 포함된 간 조직 절편을 촬영하세요. 탈파라핀화를 위해서는 슬라이드를 자일렌 또는 시트리솔브에 5분에서 15분간 담가둡니다.

그 후 100%, 95%, 70% 에탄올에 연속적으로 재수화한 후, 각각 5분간 증류수를 넣습니다. 그 다음 시리우스 레드로 해당 부분을 염색하고 슬라이드를 건조하세요. 클리어링 용액에서 한 슬라이드씩 꺼내 종이 타월에 바른 후 과도한 액체를 제거하세요.

섹션에 약 50에서 100마이크로리터의 마운팅 매체를 추가하세요. 커버 슬립으로 부분을 덮고 부드럽게 눌러 공기 방울을 제거하세요. 슬라이드를 자연 건조시키세요.

이제 4배에서 20배 대물렌즈를 사용해 밝은 시야 조명을 이용한 조광 현미경으로 준비된 부위를 관찰합니다. 약 500에서 1000마이크로리터의 간 균질산을 1.5밀리리터 원심분리관에 옮기고, 트리클로로아세트산을 첨가하여 최종 농도인 12%에 도달합니다. 튜브를 잠시 혼합하기 위해 튜브를 잠시 보텍스합니다. 튜브를 얼음물에 30분간 배양한 후, 6,000g 온도에서 4도 섭씨에서 10분간 원심분리합니다.

그 후 피펫으로 상청액을 제거하세요. 100% 얼음 차가운 에탄올을 1밀리리터 넣어 펠릿을 세척한 뒤, 초음파 처리해 완전히 재현탁시키세요. 현탁액을 다시 원심분리한 후 상정액을 흡인합니다.

세 번째 세척 후에는 튜브를 열어 10분 이상 자연 건조시키세요. 그 다음 단백질 펠릿이 담긴 튜브에 6개의 일반 염산 800마이크로리터를 추가하고, 앞서 시연한 것처럼 초음파 기계를 사용해 펠릿을 재현탁합니다. 서스펜션을 나사로 덮인 유리관이나 바이알로 옮기고 뚜껑을 단단히 밀봉하세요.

튜브를 110도 오븐에서 약 22시간 동안 부화시킵니다. 필요하다면 유리 바이알의 내용물을 원심분리관으로 옮기고 회전시키세요. 가수분해된 샘플을 16,000g 압력에서 10분간 원심분리한 후, 하이드록시프로린이 포함된 상청액을 1.5밀리리터 튜브에 흡인합니다.

하이드록시프롤린 산화를 위해서는 50마이크로리터 샘플과 표준액이 담긴 튜브에 450마이크로리터의 클로라민 용액을 첨가하세요. 튜브 안의 내용물을 소용돌이와 섞어 실온에서 25분간 배양하세요. 그 다음 각 샘플과 표준체에 에를리히 시약 500마이크로리터를 추가합니다.

소용돌이 후에는 샘플을 65도 섭씨에서 인큐베이터에서 20분간 배양합니다. 배양 후에는 튜브를 실온까지 식히고 샘플의 최종 색상을 관찰합니다. 마지막으로, 550나노미터 파장의 분광광도계를 사용하여 시료와 표준의 흡광도를 측정합니다.

피크로 시리우스 레드로 간 조직의 콜라겐 염색을 밝은 시야 조명 하에서 관찰했을 때, 콜라겐 레드에 연한 주황색 또는 노란색 배경이 나타났습니다. 섬유증에 해당하는 콜라겐 침착과 콜라겐이 혈관벽, 폐문, 간 캡슐에 염색되었습니다. 편광 현미경 검사에서는 어두운 배경에 뚜렷한 이중굴절 콜라겐 섬유가 나타나 섬유증의 시각화가 향상되었습니다.

고지방 및 과당 식이(HFFD)를 먹인 아구티 옐로우 마우스의 간 콜라겐 양성 면적 정량화는 저지방 및 과당 식이로 사료를 받은 야생형 대조군 쥐와 비교했을 때 유의하게 더 높은 섬유화가 나타났습니다. 간 하이드록시프롤린 함량의 정량화는 HFFD 식이를 섭취한 아구티 옐로우 마우스가 16주 후 대조군 마우스에 비해 유의하게 높은 수치를 보였으며, 이는 섬유화 간 내 콜라겐 침착 증가를 확인하였습니다.